ヒト造血幹細胞を対象とする遺伝子治療法を開発していく為に、動物を用いた遺伝子導入系の有効性並びに安全性を評価する体制の確立が必須である。安全性の評価、特に長期にわたる安全性の検討には、新薬の開発と同様に大型動物がよく使われているが、よりヒトに近い霊長類を用いての慎重な検討が望まれる。当研究部では細胞移植療法ならびに遺伝子治療法研究の前臨床動物として、比較的取り扱いが容易な小型霊長類コモンマーモセット(Common marmoset、Callithrix jaccus)に着目し、その一般的利用に向けての基盤技術の開発を行ってきた。コモンマーモセットを用い、細胞移植、遺伝子治療のモデル動物として使用していく上で、この動物の免疫学的基礎情報の解析が極めて有意義なことと考えられる。本研究では移植免疫学臨床研究の前臨床モデル動物としての将来の利用を目的に、分子生物学的手法により、コモンマーモセットの主要組織適合性複合体クラスI並びにクラスII DRB遺伝子とその多型性を解析した。また、移植前検査の為に、簡便解析法を新たに考案した。さらに、分子進化学の観点から理論解析を行い、進化についての情報も検討した。

　本研究の解析手順を図1に示す。

図1.コモンマーモセットMHCクラスI及びクラスII DRB遺伝子解析の手順

　クローニング法やSSCP法の解析により、新たな7種類のアリルを含む21種のコモンマーモセットMHCクラスII DRB第2エクソンアリルの塩基配列を同定した。ヒトのHLA-DRB遺伝子とのホモロジー検索結果により、核酸レベルで80〜90%の相同性が認められた。

　組織適合性検査(histocompatibility test)を行うため、上述のアリル配列情報に基づきコモンマーモセットに特異的な2組のDRB第2エクソンプライマーセットを設計し、PCR-SSCP分析法にて、DNAタイピングを行った。5家系18個体より得られたDNAを用いて、DRB遺伝子に開する家系図を検討した。同胎兄弟間に同じパターンが観察されたことからコモンマーモセットの骨髄キメラ性が支持された。

　遺伝子座数を解析するため、細胞株や組織由来のゲノムDNAサンプルを用いサザン解析を行った。コモンマーモセットのDRB遺伝子のコピー数が異なる個体でも、少なくとも4種以上は存在すると考えられた。

　各アリル遺伝子の系統関係を探る目的で、分子進化学的手法を用いて、コモンマーモセットDRB遺伝子第2エクソンの塩基配列と多種類の霊長類における同領域の塩基配列と比較し、系統樹分析を行った(図2)。新世界ザルのDRB遺伝子は旧世界ザルのDRB遺伝子と明瞭に区別するができた。この結果は、これまで考えられてきた霊長類の進化過程と符合するものであった。さらに、新世界ザルにおいてもDRB対立遺伝子多型性が種を越えて保存されている事実(transspecies polymorphisms)を示した。また、コモンマーモセットのMHC-DRB1分子の抗原認識部位と非抗原認識部位とをそれぞれコードする遺伝子DNA配列より塩基置換頻度を計算したところ、コモンマーモセットのMHC-DRB分子1ドメインの多型性が、アミノ酸の置換変化を引き起こすことが淘汰上有利となるような"正の自然淘汰"(positive selection)によって維持されている可能性を示唆した。

図2 MHC-DRB遺伝子の系統樹

　クローニング法と塩基配列解析により、20種のMHCクラスIの部分遺伝子について塩基配列を同定した。どの個体からも、10種類以上の遺伝子が観察された。コモンマーモセットのMHCクラスI第2エクソンから第3エクソンまでの領域において、系統樹を作成した結果から、MHCクラスI遺伝子は数グルーフに分けられた。そのうちの1つはMHC-G遺伝子と他の1つはMHC-E遺伝子と類似していたが、ヒトの古典的クラスIに類似する群も認められた(図3)。

図3.MHCクラスI遺伝子の系統樹

　得られたコモンマーモセットMHCクラスI遺伝子の塩基情報に基づき、それぞれの第2と第3エクソン領域に特異的な2組のプライマーセットを設計し、PCR-SSCP解析を行った。各個体からは複数のバンドが検出され、多種類アリルを持ち多型性を認めた。

　マーモセットMHCクラスI遺伝子に関する特異的部位を解析するために、染色体マッピングを行った。FISHの蛍光シグナルは大型常染色体一対のみに観察できた。その位置は、Sherlockら(1996)の命名法にしたがい、染色体第4番の長腕のセントロメアに近い広い領域上に特定できた。コモンマーモセットの第4番染色体は染色体ペインティング法により、ヒトの第6番染色体と相同であることが報告されている。従って、両種のMHCクラスI遺伝子が相同な染色体に存在していることが確認された。さらに、ゲノム構造を調べるために、MHCクラスI遺伝子のPCR増幅断片(第1から第4エクソン;FITC標識(緑色)、第4から第7エクソン;ローダミン標識(赤色))をプローブとして細胞核から伸展したDNAファイバー上でFISHを行ったところ、10個以上の緑と赤の隣接した蛍光シグナル群が、直線状のファイバーに並ぶことが観察できた。

　本研究の主要な目的としては同種造血幹細胞移植の霊長類モデルを作製する為に、その最も基礎となる主要組織適合複合体遺伝子の解析を行った。今後は本研究で確立した組織適合検査法により、コモンマーモセットでの同種間造血幹細胞移植を行い、移植後の病態を血液学的、免疫学的に検討していく予定である。