前房水を、種々のサイトカインを構成的に発現するHTLV-1感染T細胞(V-230-81,Sez細胞)の培養系に添加すると、培養上清中のIFN-およびIL-6の産生は用量依存的に抑制された。以上により、前房水中にはHTLV-1感染T細胞のサイトカインの産生を抑制する因子が存在することが示された。HU患者の前房浸出細胞においてIL-6以外の炎症性サイトカインの発現が認められなかったのは、前房水によってそれらの発現が抑制されているためと考えられ、IL-6の発現が検出されたのは前房水による抑制が相対的に弱いことによると推測される。

　前房水中に存在する抑制由子の解析を目的として、前房水をゲル濾過カラムにより分離精製した。ゲル濾過フラクションは、IFN-産生に対して4つの抑制のピークを示し、分子量サイズにおいて約25-100、10-25、10kDa以下に相当した。4つの抑制活性の分画は、既存の前房水中の免疫抑制因子である、transforming growth factor-(TGF-)、macrophage migration inhibitory factor(MIF)、vasoactive intestinal peptide (VIP)、-melanocyte stimulating hormone(-MSH)とおおよそ一致した。これらの結果より、IFN-の抑制は前房水中の複数の因子によると考えられた。

　TGF-は哺乳類の前房水において主要な免疫抑制因子であるため、前房水のIFN-産生に対する抑制作用がTGF-に起因するかについて検討した。TGF-は前房水における濃度ではIFN-産生に対して抑制活性を示さず、前房水による抑制は抗TGF-抗体により中和されなかった。以上により、TGF-はHTLV-1感染T細胞のIFN-産生を抑制する前房水中の主要な因子ではないことが示された。

　三量体として存在するsFasLの分子量(約78kDa)が、前房水の分画の中で一番分子量の大きい抑制のピークと一致することから、sFasLのIFN-に対する作用を検討した。前房水による抑制効果は抗FasL抗体により有意に中和され、精製sFasLはIFN-の産生を用量依存的に抑制し、数百pg/mlという前房水におけるsFasLの生理的濃度においても有意な抑制を示した。さらに、リコンビナントsFasLを含む培養上清をゲル濾過カラムで分画化した実験系において、sFasLが前房水のIFN-抑制活性を示す最も大きい分画と、同一の分画に含まれることが示された。以上により、SFastはHTLV-1感染T細胞のIFN-の産生を抑制する前房水中の主要な因子であり、最も分子量サイズが大きい前房水の抑制活性は、sFasLに起因することが明らかになった。sFasLは前房水中における濃度において、HTLV-1感染T細胞のIFN-産生を抑制するという、アポトーシス誘導以外の生理活性をもつ可能性が示唆された。

　FasによるHTLV-1感染T細胞のIFN-産生の抑制が、細胞のアポトーシスを介した抑制であるか、あるいはアポトーシス誘導以外のメカニズムによるものであるかについて検討した。今回実験に用いたHTLV-1感染T細胞は、Fasによるアポトーシス誘導に抵尊性であることが示され、FasによるIFN-産生の抑制はアポトーシス誘導以外のメカニズムによるものであると考えられた。

FasシグナルによるIFN-発現抑制の制御

　FasによるIFN-産生の抑制がどのレベルでおきているかについてまず、ノーザンブロット法で検討した。Fasのクロスリンメにより、特異的にIFN-のmRNAレベルが抑制されたのに対し、HTL-1やc-mycのmRNAレベルには有意な変化は認められなかった。

　IFN-のmRNAレベルの低下が転写の抑制によるものであるかについて、IF--ルシフエラーゼをレポーターとするtransientなトランスフェクションの系で検討した。精製sFasLにより、IFN-のプロモーター活性は用量依存的に抑制され、この抑制は100pg/mlという非常に低濃度においても認められた。次に、IFN-プロモーターのどの領域が抑制に関与するかを同定するために、種々のIFN-プロモーターの変異体を作成し解析した。FasのクロスリンクによるIFN-プロモーター活性の抑制は、プロモーターの中で-221から-198の領域に依存していることが示された。この24塩基の領域には、2つのYY1の結合配列と、1つのUSFやMyc/Max＼Madの結合配列であるE-boxがあり、個々の配列に塩基置換を導入し解析した。YY1(1)mut、E-box-mut、YY1(2)-mutいずれの変異体においても、Fasによるプロモーター活性の抑制が解除された。

　FasによるIFN-抑制のシグナル伝達経路の解析を目的として、Fasのアダプター蛋白質であるDaxxまたはFADDのドミナントネガティブ体をIFN--ルシフェラーゼとともにHTLV-1感染T細胞にコトランスフェクションし、IFN-抑制に対する影響を検討した。FasによるIFN-プロモーター活性の抑制は、FADDのドミナントネガティブ体では変化しなかったが、Daxxのドミナントネガティブ体により抑制は解除された。さらに、Daxxの下流に位置し、Daxxと結合してJNKの活性化およびアポトーシスを誘導するapoptosis signal-regulating kinase 1(ASK1)を用いて、シグナル伝達経路の解析を行った。ドミナントネガティブ効果を持つASK1-KMは、FasによるIFN-プロモーター活性の抑制を用量依存的に解除した。一方、ASK1のキナーゼ活性が構成的に活性化しているASK1-Nは、抗Fas抗体のクロスリンクなしに用量依存的にIFN-プロモーター活性を抑制した。これらの結果より、FasシグナルによるIFN-の抑制は、Daxx-ASK1を介したMAPキナーゼのシグナル伝達経路により制御されている可能性が示唆された。したがって、mFasLでは主にFADD-caspaseを介したアポトーシスに至る伝達経路が、sFasLでは主にDaxx-ASK-1の伝達経路が活性化し、リガンドの種類や濃度によってFasのシグナル伝達経路の使い分けが行われている可能性が考えられた。