Eu³⁺錯体の蛍光波長はキレーターの違いに無関係であり,いずれも⁵D₀→⁷F₂の遷移に伴う615nmのシャープなピークを有する.以下の3つの条件を満たし,この波長により励起されるアクセプター分子のデザイン,合成を行った:(1)安定であり,化学修飾が容易である(2)蛍光団の電子状態の変化により蛍光量子収率が変化しうる(3)水中で蛍光を有する.種々の化合物について検討した結果,Fig.2に示すSNR3がEu³⁺錯体の蛍光のアクセプターとして最適であることが判明した.

Fig.2 新規長波長励起蛍光物質

　FRETにより生じるアクセプターの蛍光を検出する目的で,ドナーに有機性蛍光物質を用い,様々なリンカーを介してSNR3と結合させた化合物を検討した.その結果,ドナーとアクセプターを立体障害が大きなステロイド骨格をリンカーに取り入れた化合物で,ドナーを励起した際にRET由来で生じるSNR3の蛍光が検出された.FRETを起こすには強固な骨格を有するリンカーが必要であること,及びSNR3がFRETのアクセプターとして用いることができることが判明した.

　蛍光性ランタノイド錯体とSNR3を同一分子内に有する,Fig.3に示す化合物(1)及び(2)をデザイン合成し,時間分解蛍光測定を行った.その結果,両化合物とも無蛍光となった.

Fig.3 Eu³⁺錯体とSNR3をリンカーを介して結合させた分子

　化合物(1)はドナーとアクセプターが分子内で会合することにより,また化合物(2)はFRETの速度定数が大きすぎることによるものと考えられる.

　化合物(2)の分子内エステル結合切断前後での時間分解蛍光スペクトルの変化をFig.4に示す.Fig.4より,切断後には,Eu³⁺錯体以外の蛍光が生じることが分かる.この新たに生じた蛍光について,Eu³⁺錯体からのFRETにより生じたSNR3の蛍光であると予測した.そこで,分子間FRETに関する検討を行った.その結果Eu³⁺錯体から5-CSNR3へ分子間でFRETが起きることが明らかになった.

Fig.4 化合物(2)のエステル切断前後での時間分解蛍光スペクトルの変化

　以上,SNR3の長寿命蛍光検出系として,Eu³⁺錯体+5-CSNR3共存系を見いだした.

　生体内分子検出系に応用するには,アクセプターの化学変換に伴う長寿命蛍光のスイッチングが不可欠である.アクセプターの化学変換に伴う量子収率の変化を共存系を用いてTRFで検出することとした.アクセプターの量子収率に変化を及ぼす化学変換のモデルにアセチル化を選択しFig.5に示すAminoSNR3及びAmideSNR3を用いて検討した.

Fig.5 共存系に用いたSNR3誘導体

　AminoSNR3共存系ではエネルギー移動は生じるものの,AminoSNR3は無蛍光であるため,655nmの蛍光は増大しなかった.一方,Amide SNR3共存系ではEu³⁺錯体からのFRETにより生じるAmideSNR3の655nmの蛍光が観測された.これらの結果はアクセプターの量子収率の変化をEu³⁺錯体+SNR3誘導体共存系により,TRFで検出できたことを示している.

　以上,合成小分子によるFRET-TRFシステム(Fig.1)の開発に成功した.本システムを用いれば,多様な生体内分子を簡便にTRFで検出でき,HTSにおけるbackground蛍光についての問題点を解決できると考えられる.

　開発したFRET-TRFを生体内分子検出に応用する際の問題点として,一般にEu³⁺錯体の蛍光強度は水中で弱いことが考えられる.蛍光性Tb³⁺錯体,Tb³⁺DTPAcs124は同じEu³⁺錯体のおよそ20倍の蛍光強度を有することが知られている.本Tb³⁺錯体をドナーに用いれば,ドナーにEu³⁺錯体を用いたときと比較して感度の上昇が期待できる.そこで本Tb³⁺錯体をドナーに用いることとした.アクセプターには当研究室で開発したNO感受性蛍光色素DAR-Mを用い,FRET-TRFによるNO検出系を確立した.FRET-TRFによるNO検出系の概念図をFig.6に示す.

Fig.6 DAR-M,DAR-MTによるFRET-TRFを用いたNOアッセイ系の概念図

　蛍光性Tb³⁺錯体の蛍光スペクトルには⁵D₄→⁷F₅の遷移に伴う545nmのシャープなピークがあり,スペクトルの形は錯体の種類によらず一定である.

　DAR-MはNOとの反応によりトリアゾール体DAR-MTを生成し,蛍光量子収率が増大する.DAR-MTは545nmで励起され584nmの蛍光を出す.Tb³⁺錯体とDAR-Mの共存系においてNOが生成すれば,Tb³⁺錯体からのFRETにより生じるDAR-MTの長寿命蛍光をTRFで検出できると考えた.

Tb³⁺錯体+DAR-M共存系を用いたFRETによるNO生成の検出

　FRETによりNO生成を検出するため,10MTb³⁺錯体と,3MDAR-MをpH7.0のリン酸buffer中で共存させた.ここに,NOC13を加えた.その時の584nmの相対蛍光強度の経時変化をFig.7に示す.尚,本スペクトルは時間分解ではなく通常の蛍光強度変化ではあるが,時間分解蛍光測定をすれば同様の結果になると考えられる.

Fig.7 Tb³⁺錯体+DAR-M共存系を用いたFRETによるNO生成の検出

　584nmの蛍光強度がNO生成と共に増大した.時間分解蛍光スペクトル,蛍光寿命の検討よりこの変化は,Tb³⁺錯体からDAR-MTへのFRETによりNO生成を検出している.本系を応用すれば,HTSでの蛍光プレートリーダーを用いたNO産生測定がTRFで可能となり,NO合成酵素誘導薬や阻害剤のアッセイ系等に応用できる.

　総括 本研究で明らかにしたことを以下に記す

　Eu³⁺錯体対応型新規長波長励起蛍光物質SNR3を開発した.

　合成小分子によるFRET-TRFシステムを開発した.

　FRET-TRFによるNO検出系の開発として,当研究室で開発したNO感受性蛍光色素DAR-M,DAR-MTを用い,FRET-TRFによるNO検出系を確立した.将来的には,加水分解酵素,Ca²⁺,Zn²⁺等様々な生体内分子のアッセイ系をFRET-TRFを用いて簡便に構築できると考えられる.

　2つの蛍光性分子(ドナーとアクセプター)が近傍に存在しドナーの蛍光波長とアクセプターの励起波長が重なり合う時、ドナーを励起することでエネルギーがアクセプターに移りその蛍光が観察される場合がある。これは蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)と呼ばれる現象である。ドナーにランタノイド錯体を用い、アクセプターにエネルギー移動が可能な合成小分子を用いれば、FRETにより生じるアクセプターの蛍光をTRFで測定できる。合成小分子の蛍光特性を生体内分子との特異的反応で変化させることで、多様な生体内分子の検出系が構築できると考えた。Eu³⁺錯体の蛍光波長はキレーターの違いに無関係であり、いずれも615nmのピークを有する。この波長により励起されるアクセプター分子のデザイン・合成を行い、SNR3が最も優れていることが明らかになった。

　FRETは2つの蛍光性分子が近傍に存在すれば必ずしも起こるわけではなく、蛍光性分子の会合で消光を起こす場合がある。そこで、SNR3をFRETに応用するため、2種類のリンカーを用いEu³⁺錯体と結合させTRFを調べた。リンカーには自由度の高いメチレン鎖(1)と、会合しにくいと考えられる強固なステロイド骨格(2)を選び、また、リンカーで結ばずにSNR3とEu³⁺錯体が共存する系についてもTRFを調べた。この結果、いずれのリンカーで結んでもFRETは起こらなかったが、共存する系では効率的にFRETが起こった。この場合のFRETは、Eu³⁺錯体の蛍光が長寿命であるため、蛍光寿命内にドナーの近傍を行き来するアクセプター分子がFRETを起こしうる半径内に存在できうる確率が高く、エネルギーを受け取ることができるため起こると考察した。つまり、ドナーに長寿命蛍光性分子を選んだ場合、アクセプターと直接結合させなくてもFRETが効率的に起こることが明らかになった。このFRET-TRF法は、アクセプターに最初は無蛍光で、生体内分子との反応により蛍光性分子に化学変換される合成小分子を選択することで生体内分子の検出に応用することができる。また、本システムは共存系という単純な系を用いているので、様々な生体内分子に対応したアクセプターをデザイン、合成することで、TRF法で特異的に検出することができる。

　開発したFRET-TRFを生体内分子検出に応用する際の問題点として、一般にEu³⁺錯体の蛍光強度は水中で弱いことが考えられる。Tb³⁺錯体はEu³⁺錯体の20倍の蛍光強度を有することが知られているため、Tb³⁺錯体をドナーに用いることとした。生体内分子検出系に応用するには、アクセプターの生体内分子との反応による量子収率の変化を用いる必要がある。アクセプターにはNOとの反応によりトリアゾール体DAR-MTを生成し、蛍光量子収率が増大するDAR-Mを用いた。FRETによりNO生成を検出するため、10mM Tb³⁺錯体と、3mMDAR-Mを共存させ、NO産生物質であるNOC13を加えた。この結果、584nmの蛍光強度がNO生成と共に増大した。時間分解蛍光スペクトル、蛍光寿命の検討よりこの変化は、Tb³⁺錯体からDAR-MTへのFRETによることが確認された。本系を応用すれば、HTSでの蛍光プレートリーダーを用いたNO産生測定がTRFで可能となる。将来的には、加水分解酵素、Ca²⁺、Zn²⁺等様々な生体内分子のアッセイ系をFRET-TRFを用いて簡便に構築できると考えられる。

　以上を要するに、本論文は、ドナー分子とアクセプター分子の共存系による新たなFRET-TRFシステムを見出し、NO等の生体内分子のアッセイ系に応用できることを示した。このFRET-TRFシステムは、簡便性及び応用の幅広さにおいて優れており、高精度なアッセイ系として用いられる可能性がある。

　これらの研究成果は、薬物のスクリーニング系の新たな原理となりうる有益な知見であり、博士(薬学)の学位として価値があるものと認められる。