大腸菌のRecQの相同遺伝子は、出芽酵母ではSGS1のひとつしか存在しない。ところが、ヒト細胞には大腸菌RecQと高い相同性をもつタンパク質をコードする遺伝子が5つ存在する。それらは、我々がクローニングしたDNAヘリカーゼQ1(RECQL1)、Bloom症候群(BS)の原因遺伝子BLM(RECQL2)、Werner症候群(WS)の原因遺伝子WRN(RECQL3)、また最近Rothmund-Thomson症候群亞群原因遺伝子RTSと同定されたRECQL4、及び、機能不明のRECQL5である。BLM、WRNとRTSはSgs1のように大腸菌RecQより長いN末端とC末端を持っているが、DNAヘリカーゼQ1/RECQL1とRECQL5は持っていない。ブルーム症候群患者は低身長(発育不全)、免疫不全、若い年で癌が多発することで知られている。細胞レベルにおいて、BS細胞では姉妹染色体間の交換が正常細胞の10倍程度亢進することが知られている。ウェルナー症候群患者では10代のころまでは普通だが、30代を過ぎた頃からいろいろな老化の症状が加速して現われる。

　本博士論文では、機能不明なDNAヘリカーゼQ1/RECQL1を含め、高等動物のRECQヘリカーゼファミリーの機能を解析することを試み、それぞれのRECQLがどのように機能の分担をしているのかを念頭において解析を進めることにした。この目的のために、実験材料として、ニワトリのB細胞由来DT40という細胞株を用いた。この細胞は高等動物細胞で唯一、ターゲッテイングインテグレーションが高率に起こる細胞で、その効率は50%にも達する。従って、細胞レベルで二重、三重RECQL遺伝子破壊細胞を容易に作ることが可能である。また、染色体のカリオタイプが安定で、RECQL欠損による染色体不安定性を染色体異常という形で定量できる利点がある。

　ヒトに5つあるRECQLファミリー遺伝子のうち、RECQL1、BLM(RECQL2)、RECQL5の3つのRECQL遺伝子破壊ニワトリDT40細胞を作製した。自然発生的SCEの上昇はBLM破壊株でのみ観察され、Werner症候群の細胞やRothmund-Thomson症候群の細胞でも観察が報告されていないことから、SCEの抑制の役割を担うのは5つのRECQLの中でBLMのみであることを確定した。また、BLM破壊株でのSCE上昇はRAD54が関与するDNA相同組換え機構により生成することを明らかにした。また、BLM破壊株でターゲッテイングインテグレーション頻度が上昇したことにより、高等動物細胞でターゲッテイングインテグレーションの効率を上げるための一手段としてBLM機能の抑制が考えられた。

　RECQL1とBLMとの二重破壊株を作製したところ、その増殖が野性株と比べて著しく遅くなった。これはBLMの機能が失われている細胞ではRECQL1が、少なくとも増殖に関連するBLMの機能を代行していることを意味し、いままで未知であったRECQL1の細胞内機能を追及するキッカケを掴めた。

　RAD54破壊状態でのBLM機能の欠損は、普通に増殖している一部の細胞にisochromachid breakという致命傷を与えた。isochromachid breakはDNA複製中に生じると考えられており、BLMはDNA複製中に過剰のDNA二重鎖切断ができないようにする機能を担っているものと考えられる。

　マウス精巣由来のRNAからRT-PCR法で2種類のRecQL1 cDNAとを得た。両者はC末端だけ異なるアミノ酸配列をコードし,はKKRKという核移行シグナルをC末端近傍にもち,はその部分の配列が異なり核移行シグナルをもっていなかった。RT-PCR法によるmRNAの発現解析の結果,RecQL1はすべての臓器で発現しているのに対し,RecQL1は精巣でのみで発現していること,また,その精巣での発現は,生後14日目以降の減数分裂期の細胞が増加する時期から上昇することを示し,RecQL1の減数分裂時のDNA組換えへの関与を示唆した。

　ニワトリ精巣のRNAを鋳型にして,RT-PCR法によりニワトリRECQL1,BLM,RECQL5のcDNAを単離し,この配列に基づきRECQL1,BLM,RECQL5のゲノムDNAをクローニングした。それぞれのゲノムDNAのヘリカーゼドメインにあたるエキソンを除き,薬剤選択マーカーを挿入してターゲティングベクターを作製し,このターゲティングベクターを用いて,RECQL1単独,BLM単独,RECQL5単独,RECQL1-BLM二重破壊株,BLM-RAD54二重破壊株をトリDT40細胞を用いて作製した。

　破壊株の解析から,RECQL1とRECQL5は増殖に必須ではないが,BLM破壊株では野生株に比べて増殖がやや遅くなり,DNA障害剤であるmethyl methansulfonateに対して感受性になることを明らかにした。Bloom症候群患者由来細胞の最も顕著な特徴は,姉妹染色分体交換(sister chromatid exchange;SCE)頻度の上昇であり,DT40のBLM破壊株でも顕著にSCE頻度が上昇していることを示した。一方,RECQL1,RECQL5の破壊株のSCE頻度は野性株と同程度であることを明らかにした。さらに,BLM破壊株で,外から導入した遺伝子がその遺伝子と相同な塩基配列をもつ部位に組み込まれる(targeted integration)効率が顕著に上がることを見出した。

　DNAの相同組換えに関与するRAD54遺伝子との二重破壊株の解析から,BLM破壊株で起きているSCEのかなりの部分が相同組換えによることを初めて明らかにした。さらに,細胞周期の進行や染色体異常の解析により,BLMの能が欠損するとDNA合成期にDNAの二本鎖切断が起き,それを相同組換えにより修復しているためにBLM破壊株ではSCEの頻度が上昇し,RAD54遺伝子が欠損し組換えが阻害されると,染色体のギャップとなって観察されることを明らかにした。

　以上を要するに,本論文ではマウスRecQL1の新規なcDNAを発見し,それが精巣特異的に発現することを見出し,コードされるタンパク質が減数分裂時のDNA組換えに関与することを示唆した。また,DT40細胞を用いた種々の遺伝子破壊細胞の作製から,Bloom症候群の患者の細胞で高頻度に観察されるSCEの生成機構を初めて明らかにした。さらに,BLMの機能が欠損するとtargeted integrationの効率が顕著に上がることを見出した。これは高等真核細胞でtargeted integrationの効率をあげる方法論の開発につながるものである。これらの成果は,真核細胞RecQヘリカーゼファミリータンパク質の機能を解明するうえで重要な知見を与え,またBloom症候群の発症機構を分子レベルで理解する手がかりを与えるものであり,博士(薬学)の学位として十分な価値があるものと認められる。