アルツハイマー病(AD)は、神経細胞自身の変調が原因となる老人性痴呆症の代表的な病気である。AD患者脳内に大量に観察される老人斑の主成分アミロイド(A)は、レセプター様一回膜貫通型構造を持つアミロイド前駆体蛋白質(APP)から生成されるが、その詳細な分子機構は未だ明らかではない。従って、APPの代謝とA生成機構を分子レベルで解明することが、AD発病の理解につながると考えられる。APPの代謝およびA生成機構に関与するシグナルは、APP細胞質ドメインに存在する事をすでに明らかにしてきた。従って、本研究は、APP細胞質ドメインに結合する蛋白質の単離を行い、その機能解析を通して、APP代謝調節機構とA生成機構に新たな知見を見出したものである。

　APP細胞質ドメイン結合蛋白質を単離する目的で、APP細胞質ドメインをbaitベクターに用いて、ヒト成人脳cDNAライブラリーに対してYeast two-hybrid法を行った。複数の陽性クローンから、既知の蛋白質X11のホモログ遺伝子である新規遺伝子X11LcDNAを単離した。同時にX11Lマウスホモログの単離も行い、アミノ酸配列で90.2%の相同性を示すマウスX11LcDNA単離も成功した。X11Lは分子中央部にPhosphotyrosine Interaction(PI)ドメインを、PIドメインのC-末端側に2つのPDZドメインを持つアダプター様の機能を持つタンパク質と考えられた。また、X11L遺伝子は、Northern blot hybridizationによりヒト、マウス共に脳に特異的に発現していた。X11は他臓器にも発現が見られる。

　X11Lが,細胞内においてもAPPと結合していることを示す目的で、APPとX11LをCOS7細胞に強制発現させ、その細胞を可溶化後、共役免疫沈降を試みた。両蛋白質を検出する抗体として,抗X11L抗体(UT-30)、抗APP抗体(UT-18、2D1、25C)を作製し、実験に用いた。その結果、両蛋白質は細胞内において相互作用をすることが証明された。また、X11Lの各ドメインコンストラクトを作製し、GST-fusion proteinとして大腸菌で発現させて精製後、APPとの結合ドメインをpull-down assayで解析した。その結果、X11LのPIドメインとAPP細胞質ドメインのNPTY配列が相互作用に必須の領域であることを明らかにした。同様な結果は、X11Lの各ドメインコンストラクトとAPPをHEK293細胞に共発現させ、両タンパク質の抗体を用いて共役免疫沈降を行った実験からも確認された。また、PIドメインのN-末端側の配列は、APPへの結合に影響を与える事が示唆された。

　X11LのA生成に及ぼす効果を調べるために、APP695を安定的に発現するHEK293細胞を作製し、これにX11Lを過発現させ、培地中に分泌されてくるA量をサンドイッチELISA法で定量した。その結果、X11Lを発現したときは発現していないときと比較してA40の生成量が減少していた。A42の生成量には影響を与えなかった。APPからのA生成を制御する分子機構を解明する目的で、X11Lの各ドメインコンストラクトを作製し、APP695を安定的に発現するHEK293細胞に過発現させ、同様にA量を定量した。APP結合能は保持しているが、PDZドメインを欠失しているN+PIやPIコンストラクトを発現させた細胞では、A40生成を抑制する効果が失われることを明らかにした。これらの実験から、X11LのAPPへの結合にはPIドメインが必須であるが、A40の生成を制御するには、C-末端側のPDZドメインが必要であることが明らかになった。

　PDZドメインは蛋白質結合ドメインと考えられていることから、X11LのC末端に存在するPDZドメインにタンパク質が結合することで、A生成を調節している可能性が示唆された。従って、次にX11LのPDZドメインに結合し、A生成に影響を及ぼす蛋白質の単離を行った。X11LのC末端に存在する2カ所のPDZドメインをbaitベクターとして用いて、ヒト成人脳cDNAライブラリーに対してYeast two-hybrid法を行い、複数の陽性クローンを得た。得られたcDNAのA生成に及ぼす効果を調べた。全長cDNAを単離し、APP695を安定的に発現するHEK293細胞に過発現させ、培地中に分泌されるA量を測定した。その結果、PDZドメインに結合し、A生成に影響を及ぼすcDNAを同定した。このcDNAは、転写調節因子として知られるNFB/p65をコードしていた。

　NFB/p65がX11LのどちらのPDZドメインを認識し結合するのかを解明する目的で、NFB/p65cDNAとX11LのPDZ1+2,PDZ1,POZ2をコードするcDNAを用いてYeast two-hybrid法を行った。その結果、NFB/p65はX11Lの2番目のPDZドメイン(PDZ2)を認識・結合する事を明らかにした。細胞内で両タンパク質が相互作用を行うことを確認する目的で、HEK293細胞にNFB/p65とX11Lを共発現させ、それぞれを特異的に認識する抗体を用いた共役免疫沈降を行った。その結果、細胞内でNFB/p65とX11Lは結合する事を明らかにした。

　NFB/p65のどの領域がX11Lと相互作用するのかを明らかにする目的で、X11LのRelホモロジードメイン(RHD)に変異を導入し、結合サイトの決定を行った。NFB/p65のRHDには、4カ所(75-SLV-77,141-FQV-143,161-FQV-163,217-DKV-219)のPDZ認識コンセンサス配列が存在する。これらにアラニン変異を導入したFLAG-RHDコンストラクトを作製し、X11LとHEK293細胞内で共発現させて、FLAG抗体を用いて共役免疫沈降を行った。その結果、161-FQV-163をAQAに置換した変異FLAG-RHDはX11Lを共沈出来なかった。この実験から、NFB/p65の161-FQV-163配列がX11Lの2番目のPDZドメインに結合する事が明らかになった。

　また、NFBの他のサブユニットNFB/p50がX11Lに結合するかどうかを共役免疫沈降実験で調べた。その結果、NFB/p50はX11Lに結合しないことを明らかにした。p50には、RDZ認識モチーフも存在しないことを確認した。NFBはホモ、ヘテロ二量体として機能することが知られているので、X11Lとp65、およびFLAG-RHO(p50)またはFLAG-RHD(p65)をCOS7細胞に共発現し、FLAG抗体を用いた共役免疫沈降により二量体がX11L結合活性を持つかどうか検討した。その結果、p50はp65とのへテロ二量体でもX11L結合活性がないことを明らかにした。

　NFB/p65がAの生成に影響を与えるかどうかを検討した。APP695を安定的に発現しているHEK293細胞にNFB/p65を過発現させると、A42の生成量が上昇するが、同時にX11Lを発現させた細胞ではA42の生成増加は抑制される事を明らかにした。A40の生成には影響を与えなかった。NFB/p65が遺伝子発現を介して機能していることをBモチーフを持つluciferase reporter gene assayにより解析した。神経細胞および非神経細胞で、リポーター遺伝子と共にNFB/p65を発現させると、NFB/p65はBモチーフ依存的転写活性を促進したが、この細胞にX11Lを同時に発現させるとBモチーフ依存的転写活性は抑制された。これらの結果は、NF8/p65が細胞内で未同定の遺伝子の転写を活性化し、その遺伝子産物がA42の生成に関与していることを示した。また、X11Lは細胞質にNFB/p65を捕捉しておくことで、未同定の遺伝子の転写を抑制すると考えられた。X11Lに対する結合活性は保持しているが転写活性機能を失った変異NFB/p65を作製して、同様な実験を行ったところ、A42の生成増加活性は示さない事を明らかにした。この実験は上記可能性を支持すると考えられる。

　以上、本研究により、APP細胞質ドメイン結合タンパク質X11Lが初めて単離された。また、X11LがAの生成を調節している分子機構が初めて明らかになった。さらに、A42とA40の生成機構が異なる可能性を示し、A42生成に関与する遺伝子を解明する新たな実験方法を開拓した。これらの多くの新発見を含む研究成果は、アルツハイマー病の発病原因の1つとされている-アミロイドの生成機構を解明する上で、大きく貢献すると考えられるので、博士(薬学)の授与に値するものと判断した。