海馬の主要な興奮性シナプスと抑制性シナプスでは、それぞれグルタミン酸(Glu)と-アミノ酪酸(GABA)を神経伝達物質として含むことが知られている。興奮性及び抑制性シナプス伝達における可塑性について検討するためには、両シナプス応答を分離することが必要になる。そこで、スライスパッチクランプ法を用いて単一細胞からシナプス後電流(postsynaptic currents:PSCs)を記録し、その電気生理学的・薬理学的特性について検討した。12-18日齢のWistar系ラットより厚さ300mの海馬切片を作製し、CA1野錐体細胞においてvoltage-clamp条件下でwhole cell patch clamp記録した(Fig.1A)。刺激電極はCA1野錐体細胞層に刺入し、記録細胞の近傍に存在するシナプス入力線維を刺激した。細胞内液の組成(mM)は、CsMeSO₃:120,CsCl:20,MgCl₂・6H₂O:1.0,CaCl₂・2H₂O:0.1,HEPES:10,EGTA:1.0,MgATP:4.0,Na₂GTP:0.4とした。通常使用するK⁺の代わりにCs⁺を用いることでK⁺チャネルを抑制し、脱分極側でも膜電位を正確に保持し、シナプス応答記録を行えるようにした。

Fig.1 (A)Placement of recording and stimulation electrodes for whole cell patch clamp recording in the hippocampal slice preparation.(B)I-V relationship of excitatory synaptic transmission.Postsynaptic currents were recorded in the presence of bicuculline(50 M). Excitatory postsynaptic currents(EPSCs)were completely blocked by CNQX(20 M)and _DL-APV(100 M).(C)I-V relationship of inhibitory synaptic transmission.Postsynaptic currents were recorded in the presence of CNQX(20 M)and _DL-APV(100 M).Application of bicuculline(50 M)abolished inhibitory postsynaptic currents(IPSCs)completely.

　まず、興奮性シナプス後電流(excitatory postsynaptic currents:EPSCs)について電流-電圧相関を作成した(Fig.1B)。灌流する人工脳脊髄液(artificial cerebrospinal fluid:ACSF)にはGABA_A受容体を抑制する目的でbicuculline50Mを添加した。また、GABA_B受容体成分は細胞内液中のCs⁺によってK⁺チャネルが抑制されるため無視できる。以上のようにして薬理学的に単離したEPSCsの振幅と細胞の膜電位の間にはほぼ直線関係が得られ、その極性は0mV付近の膜電位で逆転した。これは一価カチオンチャネルの開口を想定したときの理論値とほぼ一致する。AMPA受容体拮抗薬CNQX20M存在下ではEPSCsは過分極側で強く抑制された。この残存する応答はNMDA受容体拮抗薬APV100Mによって完全に消失したことからNMDA受容体成分であると考えられた。一方、ACSFにCNQX20MとAPV100Mを加えた条件でPSCsを記録すると抑制性シナプス後電流(inhibitory postsynaptic currents:IPSCs)が薬理学的に単離された(Fig.1C)。電流-電圧相関は、膜電位が-40mV付近で極性が逆転する直線関係となった。さらに、この応答はbicuculline50M添加によって完全に抑制された。このことから、この応答はGABA_A受容体と共役しているCl^-チャネルが開口した結果と考えられた。

　以上の結果より、V_H＝-70mV以下で記録されるPSCsはEPSCsのAMPA受容体成分とIPSCsのGABA_A受容体成分によってのみ構成されることが明らかになった。さらに、AMPA受容体拮抗薬とGABA_A受容体拮抗薬を使い分けることで興奮性及び抑制性シナプス応答の分離が可能であることが示された。

　上記のようにして単離した抑制性シナプス応答に対し、細胞の脱分極を妨げないようにcurrent-clamp条件下でシータ波様刺激(theta burst stimulation:TBS)[100Hz4pulses×10,200ms]を与えた。TBS直後、IPSC振幅は一過性に減弱(STD_GABA-A)した。一方、10秒間隔で3回シータ波様刺激(TBS×3)を与えるとSTD_GABA-Aの後に持続的なIPSC振幅の減弱(LTD_GABA-A)が観察された(Fig.2A)。TBS×3後20分のIPSCの振幅平均値は65.5±5.7%であった。また、対照群では顕著な変化は見られなかったことから、今回観察された現象はrun downによるものではないと考えられた。以上の結果より、海馬CA1野錐体細胞に入力する抑制性シナプスでは入力刺激の頻度に依存して可塑的変化が誘導されることが明らかになった。

　次に、抑制性シナプス可塑性の誘導機構について検討した(Fig.2B)。海馬CA1野錐体細胞に入力する興奮性シナプスの可塑性の誘導にはシナプス後細胞でのCa²⁺レベルの上昇が重要な役割を果たしていることが様々な知見から示唆されている。そこで、細胞内Ca²⁺を十分にキレートすることを目的として細胞内液のEGTA1.0mMをBAPTA-10mMに置換し、その影響を検討した。BAPTA10mMの細胞内負荷によりTBS×3直後の一過性の減弱を除いてLTD_GABA-A誘導は完全に抑制された。このことから、LTD_GABA-Aの誘導にはシナプス後細胞でのCa²⁺濃度の上昇が必要であることが示唆された。また、STD_GABA-Aはシナプス後細胞のCa²⁺度に依存しない成分であることが明らかになった。

Fig.2 (A)Application of theta burst stimuli (TBS)produced a long-lasting depression of inhibitory synaptic transmission(LTD_GABA-A).GABA_A receptor-mediated postsynaptic currents were recorded at the holding potential of -70 mV in the continual presence of CNQX(20 M).TBS was given at the time 0,indicated by arrowhead.(B)Changes in response amplitude at 20 min after the application of TBS(n＝5).LTD_GABA-A is induced by the Ca²⁺ influx through NMDA receptor channels.

　次に、抑制性シナプス可塑性の誘導にシナプス後細胞膜の脱分極が関与するか検討した。TBS×3によって起こる細胞膜の脱分極を阻害するため、voltage-clamp条件下(V_H＝-70mV)でTBS×3を与えた。この条件ではSTD_GABA-Aは影響を受けなかったがLTD_GABA-Aは完全に消失し、むしろわずかに持続的なIPSC振幅の増強が観察された。一方、対照群や細胞膜を脱分極させた状態(V_H＝-10mV)で条件刺激を与えた群ではLTD_GABA-Aが誘導された。これらの結果は、LTD_GABA-Aの誘導にはシナプス後細胞の脱分極が必要であることを示唆している。

　LTD_GABA-Aを誘導するCa²⁺供給源としては1)NMDA受容体、2)電位依存性Ca²⁺チャネル(voltage-dependent calcium channel:VDCC)、3)細胞内Ca²⁺ストアの三つの経路が考えられる。そこで、どの経路がLTD_GABA-A誘導に関与しているか検討した。NMDA受容体拮抗薬であるAPV100M存在下では、LTD_GABA-Aは完全に消失し、むしろ顕著に持続的なIPSC振幅の増強が観察された。しかし、L-type VDCC阻害薬nicardipine(5M)や細胞内Ca²⁺ストア涸渇薬thapsigargin(5M)は何ら影響を与えなかった。これらの結果から、LTD_GABA-Aの誘導にはNMDA受容体からのCa²⁺流入が必要であることが示唆された。

　前章からNMDA受容体を抑制した状態ではTBS×3によって一過性のIPSC振輻の減弱(STD_GABA-A)の後、持続的なIPSC振幅の増強(LTP_GABA-A)が誘導されることが示された(Fig.3A)。TBS×3後30分のIPSCの振幅平均値は153.4±8.0%であった。このことから、海馬CA1野錐体細胞に入力する抑制性シナプスでは入力刺激の頻度に依存して複数の可塑的変化(STD_GABA-A、LTD_GABA-A、LTP_GABA-A)が誘導されることが明らかになった。そこで、LTP_GABA-Aの誘導機構について検討した(Fig.3B)。まず、シナプス後細胞でのCa²⁺の関与を調べるためにBAPTA10mMを細胞内に負荷した。このような条件ではTBS×3直後の一過性の減弱を除いてLTP_GABA-A誘導は完全に抑制された。このことから、LTP_GABA-Aの誘導にもLTD_GABA-Aと同様にシナプス後細胞でのCa²⁺濃度の上昇が必要であることが示唆された。

Fig.3 (A)In the presence of CNQX(20 M)and _DL-APV(100 M),application of TBS(arrowhead)induced a short-term depression and a subsequent long-term potentiation of IPSC(LTP_GABA-A).(B)Changes in response amplitude at 30 min after TBS(n＝5).LTP_GABA-A requires IP₃-mediated Ca²⁺ release from the intracellular stores.

　次に、LTP_GABA-A誘導にシナプス後細胞膜の脱分極が必要か検討した。前章と同様に、細胞膜の脱分極を阻害するためvoltage-clamp条件下でTBS×3を与えた。しかし、この条件ではLTP_GABA-Aの誘導に何ら影響はなかった。これより、LTP_GABA-A誘導にはシナプス後細胞の膜電位変化が必要ではないことが示唆された。

　以上の結果から、LTP_GABA-A誘導をもたらすCa²⁺供給源として細胞内Ca²⁺ストアが考えられた。そこで、thapsigargin5Mの適用により細胞内Ca²⁺ストアを涸渇させ、この条件でLTP_GABA-Aが誘導されるか検討した。thapsigarginによりLTP_GABA-A誘導は完全に抑制された。このことから、LTD_GABA-Aの誘導には細胞内Ca²⁺ストアからCa²⁺が放出されることが必要であると考えられる。このCa²⁺動員系を駆動する経路の一つとしてIP₃産生カスケードの活性化が考えられた。そこで、IP₃産生カスケードを阻害することを目的としてPLC阻害剤U73122(5M)あるいはGTPアナログGTPS(0.4mM)のLTP_GABA-A誘導に対する影響について検討した。U73122存在下では、LTP_GABA-Aは完全に抑制された。また、GTPSの細胞内負荷によりLTP_GABA-Aの誘導は抑制された。これらの結果から、LTP_GABA-Aの誘導にはG蛋白質共役型受容体の活性化とそれに伴うIP₃産生カスケードの活性化が必要であることが示唆された。