No | 115887 | |
著者(漢字) | 槇尾,匡 | |
著者(英字) | ||
著者(カナ) | マキオ,タダシ | |
標題(和) | シャペロニンGroELによる標的認識の分子機 | |
標題(洋) | Molecular Mechanism of Target Recognition by the Chaperonin GroEL | |
報告番号 | 115887 | |
報告番号 | 甲15887 | |
学位授与日 | 2001.03.29 | |
学位種別 | 課程博士 | |
学位種類 | 博士(理学) | |
学位記番号 | 博理第3931号 | |
研究科 | 理学系研究科 | |
専攻 | 物理学専攻 | |
論文審査委員 | ||
内容要旨 | 細胞内のタンパク質のフォールディングには、分子シャペロンと呼ばれる一群のタンパク質が関与していることが知られている。構造形成途上にあるタンパク質は疎水的なアミノ酸を露出しており細胞中のような高濃度のタンパク質環境では非可逆的な会合を起こしてしまうが、分子シャペロンはこのようなタンパク質を認識し、結合することによりタンパク質の会合を防いでいる。分子シャペロンの中で最もよく研究されてきたのは大腸菌のシャペロニンGroELである。GroELはATPを加水分解し、コ・シャペロニンであるGroESと結合、解離を繰り返しながタンパク質のフォールディングを助けていることが知られており、ヌクレオチドとの関わりがGroELの機能に重要な役割を果たしている。これまでにヌクレオチド存在下でGroELの標的タンパク質との親和性が低下することが知られているが、その分子メカニズムについてはいまだに明らかになっていない。私は以前の研究で、GroELとα-lactalbumin(αLA)巻き戻り中間体との相互作用の様子を様々なヌクレオチド存在下で調べた。両者の相互作用はATPの存在下で大きく低下したが、ADPや、ATPアナログであるAMP-PNPの存在下ではあまり変化しなかった。ATPによる標的タンパク質との相互作用の低下がATPの結合、加水分解どちらによって引き起こされているのか。もし、ATPの結合のみで標的タンパク質との親和性の大きな低下が起こるのだとしたら、ATPとADPで親和性低下の様子が異なるのはなぜか。このような疑問に答えるためには、ヌクレオチド存在下におけるGroELの標的タンパク質との親和性低下の分子メカニズムに対する理解が不可欠である。 私はGroELの変異体D398Aを作成し、標的タンパク質の認識の様子を野生型GroELと比較した。D398A変異体はATPを野生型GroELと同様結合するものの、ATPの加水分解が大きく抑えられている(加水分解の1サイクルに6分以上かかる)。D398A変異体では、ATP加水分解サイクルにおいて中間体が蓄積していると考えられる。このような変異体を用いることで、ATPの加水分解を伴わない、ATPの結合のみによるGroELの標的タンパク質との親和性変化を調べることができると期待される。私はα-lactalbumin(αLA)の巻き戻り反応を野生型GroELやD398A変異体、そして様々な濃度のATP、ADP存在下で測定し、数値解析によりGroELとαLA巻き戻り中間体との相互作用の変化について研究した。 様々な濃度のATP存在下での野生型GroELやD398A変異体とαLA巻き戻り中間体との相互作用について調べたところ、すべてのATP濃度にわたって両者のαLA巻き戻り中間体との結合定数は同一となった。またD398A変異体については、ATPを加えてからの時間を変えてαLA巻き戻り中間体との相互作用を測定した。結果、定常状態でのATP加水分解の1サイクルより顕著に早く(15秒以内)両者の相互作用が変化していることが分かった。このことからGroELの標的タンパク質との相互作用の低下には定常的なATP加水分解は必要でないことが示唆される。 ヌクレオチド存在下でのGroELと標的タンパク質との親和性低下は、ヌクレオチド結合に伴うGroELの標的タンパク質との親和性の高い状態から低い状態への転移によるものであると考えられる。これまでの研究においてGroELのATP加水分解速度のATP濃度依存性等がMWCモデルによって解析され、GroELに協同的な構造変化の存在することが示唆されている。そこで今回の研究においてもATPによって引き起こされる転移の分子メカニズムとしてMWCモデルを考えた。GroELのモノマーがGT、GRの二つの状態をとることができるとする。GT状態は標的タンパク質との親和性が高く、ヌクレオチドとの親和性が低い。GR状態は逆に、標的タンパク質との親和性が低く、ヌクレオチドとの親和性が高い。リングを構成するすべてのモノマーが同時にはGT、GRのどちらかしかとれないとすると、ヌクレオチドの濃度にしたがって協同的な転移が起こることになる。ATPによって標的タンパク質との結合の強い状態(GT)から弱い状態(GR)への転移が起き、標的タンパク質とそれぞれKTbとBKTbなる結合定数で相互作用しATPとはそれぞれKSR/γとKsRなる結合定数で相互作用するとすると、見かけの結合定数は となる。ここでLはATPの存在しないときのGTとGRの比である。フィッティングの結果得られたパラメータの値を表1に、理論曲線を図1(A)に示す。ATPによるGTからGRへの転移は協同的になった。また、GTからGRへの転移の起こるATP濃度領域が他の研究から得られた協同的な構造変化の起こるATP濃度領域と一致した。GroELはATPによる協同的な構造変化に伴って標的タンパク質との親和性を低下させていることが分かった。 同様に様々な濃度のADP存在下での野生型GroELやD398A変異体とαLA巻き戻り中間体との相互作用について調べた(図1(B)(C))。ATPのときと同様の解析を行うと、野生型GroELの転移については協同性が低く、また、どんなにADP濃度を上げてもGT状態がATPの場合に比べ顕著に残ることが分かった(表1)。一方、D398Aについては野生型GroELに見られたものと同様の非協同的な転移に加えて、非常にゆっくり起こる協同的な転移も見られた(図1(C))。 まとめると、 1.野生型GroELやD398A変異体存在中のαLAの巻き戻り反応を様々な濃度のADP、ATP中で測定し、数値解析によりGroELとαLA巻き戻り中間体の結合定数を求めた。 2.定常的に起こるATP加水分解はGroELと標的タンパク質との親和性低下と関係ない。 3.測定したすべてのATP濃度範囲において標的タンパク質との親和性は野生型GroELとD398A変異体とで同一だった。これから、D398AのGR状態はGroELのGR状態と同等であると示唆される。 4.ATPにより引き起こされる野生型GroELのGTからGRへの転移は協同的だった。 5.ADPにより引き起こされる野生型GroELの転移は非協同的だった。しかしD398Aにおいては、野生型に見られたものと同様の転移に引き続いてゆっくりとした協同的な転移が見られた。 6.GroELはATPによる協同的な構造変化に伴って標的タンパク質との親和性を低下させている。 表1 式(1)を図1の実験データにフィッティングして得られたパラメータの値 図1 ヌクレオチド濃度を変えたときのGroELとαLA巻き戻り中間体との結合定数の変化(A)ヌクレオチドとしてATPを用いた場合。(B)(C)ヌクレオチドとしてADPを用いた場合。GroELとαLA巻き戻り中間体との相互作用の測定より前にGroELとADPを混合しておいたもの(with preincubation)と、測定時にADPを加えたもの(without preincubation)を重ねている。(B)はGroELとして野生型GroELを、(C)はD398A変異体を用いた。 | |
審査要旨 | 本論文は1編5章からなり、第1章は序論、第2章は材料、第3章は方法、第4章は結果、第5章は考察となっている。 第1章では本論文で行われた研究の背景と目的について述べられている。細胞内のタンパク質のフォールデイングには、分子シャペロニンと呼ばれる一群のタンパク質が関与している。構造形成途上にあるタンパク質は疎水的なアミノ酸を露出しているため、細胞中のようにタンパク質濃度が高いと非可逆的な会合を起こしてしまう。分子シャペロニンはこのようなタンパク質に結合して会合を防ぐことによりタンパク質のフォールディングを助けでいる。分子シャペロニンの機能にはヌクレオチドが深く関与していることが知られているが、論文提出者は大腸菌の分子シャペロニンであるGroELとα-lactalbumin(αLA)の巻き戻り中間体を標的タンパク質とする系ですでにこのことを明らかにしている。両者の相互作用はATP存在下で大きく低下し、ADPおよびATPアナログであるAMP-PNPの存在下ではあまり変化がない。これらの研究結果を踏まえ、本論文の研究ではATPがGroELと標的タンパク質との相互作用の低下を引き起こす分子機構を明らかにするとともに、ATPとADPで親和性低下の様子が異なる原因を突き止めることを行っている。 第2章および第3章では、本論文の研究で使用された実験材料と実験方法について述べられている。論文提出者は、GroELと標的タンパク質との相互作用の低下がATPの結合そのものにより引き起こされるのか、それともATPの加水分解によって引き起こされるのかを明らかにするために、野生型GroELの398番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したD398A変異体を調製した。この変異体は野生型と同じようにATPと結合するが、野生型に比べてATPの加水分解は大きく抑えられている。したがって、この変異体を用いると、ATPの加水分解が起こる前のATP結合のみによるGroELの標的タンパク質との親和性変化を調べることができる。 GroELと標的タンパク質であるαLAとの相互作用の強さは、酸変性されたαLAが中性環境下で2状態転移的に巻き戻る過程の緩和時間の変化から決定された。ストップト・フロー装置を用いてpHジャンプを行い、トリプトファンの蛍光強度変によりαLAの巻き戻り緩和を観測している。αLAがGroELに結合すると、見かけ上の巻き戻り緩和時間は長くなる。この緩和をαLAの巻き戻りとGroELへの結合の両方が存在する反応式に当てはめて解析することにより、αLAのGroELへの結合定数が決定された。ヌクレオチドの濃度を変えて結合定数を測定した結果はMWCモデルで解析されている。これらの解析においてパラメータの値を決定する際には非線形最小二乗法が使用された。 第4章では第2章および3章で述べられている実験材料と方法を用いて得られた結果が詳細に述べられ、第5章では結果についての考察が行われている。様々な濃度のATP存在下で、野生型GroELおよびD398A変異体とαLA巻き戻り中間体との相互作用を調べたところ、すべてのATP濃度において両者のαLA巻き戻り中間体との結合定数は同じであった。またD398A変異体についてATPにおいて両者のαLA巻き戻り中間体との結合定数は同じであった。またD398A変異体についてATPを加えてからの時間を変えてαLA巻き戻り中間体との相互作用を測定した結果、定常状態でのATP加水分解の1サイクルよりはるかに短い時間で両者の相互作用が変化していることがわかった。これらのことからGroELの標的タンパク質との相互作用の低下には定常的なATP加水分解は必要でないことが示唆された。 これまでの研究において、GroELのATP加水分解速度のATP濃度依存性等がMWCモデルによって解析され、GroELに協同的な構造変化の存在することが報告されている。そこで本論文の研究においても、GroELと標的タンパク質の結合定数のATP濃度依存性をMWCモデルで解析することが行われた。このモデルではGroELのモノマーはGTとGRの2つの状態をとることができる。GT状態は標的タンパク質との親和性が高く、ヌクレオチドとの親和性が低い。一方、GR状態は標的タンパク質との親和性が低く、ヌクレオチドとの親和性が高い。GroELのリングを構成するすべてのモノマーが同時にGT、GRのどちらかの状態しかとれないとすると、ヌクレオチドの濃度にしたがって協同的転移が起こることになる。解析の結果、ATPによるGTからGRへの転移は協同的であることがわかった。また、GTからGRへの転移が起こるATP濃度領域は他の研究から得られた協同的構造変化の起こるATP濃度領域と一致した。これらのことから、GroELはATPによる協同的な構造変化に伴って標的タンパク質との親和性を低下させていることがわかった。 ADPについてもATPのときと同様の解析が行われ、野生型GroELの転移については協同性が低く、また、どんなにADP濃度を上げても標的タンパク質に対する親和性の高いGT状態がATPの場合に比べ顕著に残ることがわかった。一方、D398A変異体については野生型GroELに見られたものと同様の非協同的な転移に加えて、非常にゆっくり起こる協同的な転移も見られた。 以上のように、論文提出者は標的タンパク質であるαLA巻き戻り中間体と野生型GroELおよびその変異体D398Aとの相互作用を比較することにより、ATPがGroELと標的タンパク質との相互作用の低下を引き起こす分子機構を明らかにするとともに、ATPとADPで親和性低下の様子が異なる原因を突き止めることに成功した。本論文の研究により、分子シャペロニンGroELによる標的タンパク質認識の分子機構に対する理解がより深まったと考えられる。 なお、本論文は、高須悦子、新井宗仁、桑島邦博との共同研究であるが、論文提出者が主体となって研究を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。 | |
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