ロイコトリエンB4(LTB4)は5-リポキシゲナーゼとLTA4水解酵素により、アラキドン酸より合成される生理活性脂質であり、白血球を刺激し、血管内細胞への接着、走化、ライソソーム酵素の放出を促進する。感染や外来異物の侵入に対する生体防御に重要な役割を担っている-方で、気管支喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチ等の炎症性疾患の進行にも増悪因子として関与している。また、LTB4が核内レセプターであるPPARαのリガンドであることが知られており、LTB4がPPARαに結合することにより、主としてβ、ω酸化を行う諸酵素の発現を上昇させ、この結果LTB4の肝臓での代謝分解が促進され、炎症反応の消退につながる。LTB4の細胞膜受容体であるヒトロイコトリエンB4受容体(BLT1)は、352アミノ酸残基からなる7回膜貫通型のGタンパク質共役型受容体である。なお、ラットをモデル動物とした高脂血症による腎障害、急性虚血再灌流による腎障害、免疫複合体による肺障害において、LTB4は病態進行に関与していることが報告されている。高脂血症のモデルラットではBLT拮抗薬を投与することにより、腎機能の悪化が認められなくなり、組織学的な障害も軽度となっている。また、腎移植後の急性腎不全のモデルである虚血再灌流腎では、BLT1を発現させたCHO細胞が、障害の高度な腎皮髄境界領域に集積することが観察されている。これらのモデルより、LTB4が腎障害の進行に関与することが示されていたが、ラットBLT1の一次構造は不明であった。ラットを用いた動物モデルにおける解析を容易にする目的でラットBLT1をクローニングし、解析を行った。

　ラットBLT1をラットゲノムライブラリーよりクローニングした。Gタンパク質共役型受容体では第2,7細胞膜貫通領域の相同性が高いため、ヒトBLTの第2,7細胞膜貫通領域に相当する部分をもとにプライマーをデザインし、ラット腹腔内多核白血球cDNAを鋳型としたPCRを行い、ラットBLT1部分cDNAを単離した。このラットBIT1部分cDNA(671bps)をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションにより、ラットゲノムライブラリーからラットBLT1全長をクローニングした。ラットBLT1は351アミノ酸よりなる7回膜貫通型のGタンパク質共役型受容体と推定され、ヒト、マウス、モルモットの受容体と各々、80.2、93.2、71.6%の高いアミノ酸同-性を有していた。特に、リガンドの認識に重要であると推定されている第2、7細胞膜貫通領域のアミノ酸の配列は高度に保存されていた。また他のGタンパク質共役型受容体でも保存されており、細胞内情報伝達に重要と考えられている第3細胞内領域は、ラット、ヒト、マウスの間で完全に保存されていた。また、細胞膜外のジスルフィド結合を形成すると考えられる細胞外の2つのシステイン残基、DRYモチーフに相当すると考えられるDRS配列や、NPXXYモチーフ、プロテインキナーゼCのリン酸化ターゲットとなりうるセリン、スレオニン残基も存在した。

　クローニングした受容体がラットBLT1であることを確認するために、LTB4結合解析を行った。ラットBLTI ORFをサブクローニングした発現ベクターをHEK293細胞にリポフェクション法にて強制発現させた。その膜画分を分離して、[3H]LTB4結合解析を行ったところ、有意な結合を認めた。スキャッチャード解析にて、ラットBLT1はLTB4に対して解離定数0.68nMと特異的結合を示した。

　ラットの臓器におけるBLT1の発現をノーザンブロット法により検討した。カゼインで誘導した腹腔内多型核白血球にはBHT1の発現を認めたが、脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸では発現が全く認められなかった。これらの正常臓器ではBLT1の発現を認めなかったが、BIT1拮抗薬が有効であるラット病態モデルが報告されていることから、定常状態では発現していないBLT1が、刺激により発現してくることが推測された。そこで、BLT1発現誘導の有無を検討することとした。ラットの常在腹腔内マクロファージと、プロテオースペプトンの腹腔内投与により腹腔内に誘導されてきたマクロファージでBLT1の発現をノーザンブロット解析で観察した。常在マクロファージではBLT1の発現がほとんど認められなかったのに対して、プロテオースペプトン誘導マクロファージでは著明な発現の増加を認めた。これらの結果より、BLT1の発現は刺激により誘導されることが示唆され、他のインターロイキンー8(IL-8)受容体やアンギオテンシンII受容体と同様に転写レベルでの制御が行われていると想定された。

　近年、BLT1のプロモーター領域の解析により、基本転写因子がSp1であることが報告された。さらに、BLT1転写領域のメチル化がBLT1の発現を抑制しており、このメチル化がBLT1発現の組織特異性に関係していると考えられている。しかしながらBLT1の発現誘導のメカニズムは不明であったため、刺激誘導時のBLT1転写制御の解析を行うこととした。培養細胞に様々な刺激を加えた時のBLT1の発現量の変化をノーザンブロットにより検討した。マクロファージにザイモザン貪食、リポポリサッカライド(LPS)、インターロイキン-IL-1β(IL-1β)、インターロイキンー5(IL-5)、腫瘍壊死因子(TNF-α)の刺激を加えると、好中球の走化性が増大するという報告があることより、マクロファージに同様の刺激を加えて、BLT1の発現が誘導されるかを検討した。

　まず、貪食刺激によるBLT1発現の変化を観察した。マクロファージ系である培養細胞THP-1細胞にザイモザンを貪食させ、貪食していることを蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーで確認した。ザイモザンをオプソニン化することにより、THP-1細胞の貪食能は約10倍に増加した。そこで、オプソニン化したザイモザンをTHP-1細胞に貪食させ、BLT1の発現量の変化を時間を追ってノーザンブロットで解析したが、BHT1の発現量に変化は認められなかった。次いで、THP-1細胞にLPS10ng/ml、IL-1β10ng/ml、IL-510ng/ml、TNF-α10ng/mlを加え、同様に時間を追って、BLT1の発現量の変化をノーザンブロット解析にて観察した。その結果、LPS、TNF-αで刺激した時にBLT1の発現の増加が認められた。LPS、TNF-α刺激による受容体発現誘導に関与している転写因子としてNuclear Factor-κB(NF-κB)が知られており、ヒトBLT1プロモーター領域にNF-κB結合部位と推定される塩基配列を認めることからも、BLT1の発現誘導にNF-κBが関与している可能性が考えられた。NF-κBについては、最近のノックアウトマウスの研究により、免疫細胞の活性化、アポトーシスのコントロール、癌化に関与していることがしめされている。また、NF-κBを阻害することにより、これらの病態が改善することが確認された動物モデルも報告されており、今後はNF-κB阻害による抗炎症作用を利用した治療法が期待されている。炎症時におけるBHT1の誘導発現や、誘導発現時の転写におけるNF-κBの関与は興味深い点である。

　そこで、LPS刺激によるBLT1の発現誘導にNF-κBが関与しているかどうかを検討する目的で、NF-κB結合部位と推定される配列を欠失させたベクターを作製し、ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、NF-κBがBLT1の発現に関与していることを示唆する結果は得られなかった。今後もBLT1の発現誘導に関しては更なる検討が必要と考えられる。

　本研究は、ラットロイコトリエンB4受容体(BLT1)をクローニングし、受容体のLTB4結合能、臓器及びマクロファージにおける発現を検討したものであり、下記の結果を得ている。

1.　ヒトBIT1の第2,7細胞膜貫通領域に相当する部分をもとにプライマーをデザインし、ラット腹腔内多核白血球cDNAを鋳型としたPCRを行い、ラットBLT1部分cDNA(671bps)を単離した。このラットBLT1部分cDNAをプローブとしたプラークハイブリダイゼーションにより、ラットBLT1全長を単離した。ラットBLT1は351アミノ酸よりなる7回膜貫通型のGタンパク質共役型受容体と推定され、ヒト、マウス、モルモットの受容体と各々、80.2、93.2、71.6%の高いアミノ酸同一性を有していた。特に、第2、7細胞膜貫通領域のアミノ酸は高度に保存されていた。また、他のGタンパク質共役型受容体でも保存されており、細胞内情報伝達に重要と考えられている第3細胞内領域も高度に保存されていた。DRYモチーフに相当すると考えられるDRS配列や、NPXXYモチーフ、プロテインキナーゼCのリン酸化ターゲットとなりうるセリン、スレオニン残基も存在した。

2.　この受容体をHEK293細胞にリポフェクション法にて強制発現させると、その膜画分はLTB4に対して解離定数0.68nMの特異的結合を示した。

3.　ラットの臓器におけるBLT1の発現をノーザンブロット法により検討したところ、カゼイン腹腔内投与により浸潤してきた腹腔内多型核白血球にはBLT1の発現を認めたが、脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸では発現が全く認められなかった。

4.　ラットの常在腹腔内マクロファージと、プロテオースペプトン腹腔内投与による浸潤マクロファージでBLT1の発現をノーザンブロット解析で観察した。常在性のマクロファージではBLT1の発現がほとんど認められなかったのに対して、プロテオースペプトン刺激による浸潤マクロファージでは著明な発現の増加を認めた。これらの結果より、BLT1の発現は刺激により誘導されることが示唆された。

5.　培養細胞に様々な刺激を加えた時のBLT1の発現量の変化をノーザンブロットにより検討した。THP-1細胞に刺激として、ザイモザン貧食、リポポリサッカライド(LPS)、インターロイキンーIL-1β(IL-1β)、インターロイキンー5(IL-5)、腫瘍壊死因子(TNF-α)を加え、BLT1の発現量の変化を観察した。その結果、LPS、TNF-αで刺激した際にBLT1の発現の増加が認められた。

6.　LPS刺激による受容体発現誘導に関与している転写因子としてNuclearFactor-κB(NF-κB)が知られており、ヒトBLT1プロモーター領域にNF-κB結合部位と推定される塩基配列を認めることからも、BLT1の発現誘導にNF-κBが関与している可能性が考えられた。そこで、LPS刺激によるBLT1の発現誘導にNF-κBが関与しているかどうかを検討するためにルシフェラーゼアッセイを行ったが、NF-κBがBLT1の発現に関与していることを示唆する結果は得られなかった。

以上、本論文では、ラットBLT1を単離し、受容体化学的な解析を行い、さらにその臓器分布とマクロファージにおける転写誘導を示した。ラットBLT1の単離は今後の動物モデルを用いたロイコトリエンB4の生体内の役割の解明に重要な貢献を成すものと期待され、学位の授与に値するものと考えられる。