ペルオキシゾーム病とは細胞内小器官であるペルオキシゾームの形成や代謝機構に異常をきたす遺伝性疾患の総称であり、臨床症状によりZellweger症候群(ZS)、乳児型Refsum病(IRD)、新生児型Adrenoleukodystrophy(NALD)の三種類に分類される。ペルオキシゾームの機能は、多岐にわたり、その結果としてペルオキシゾーム病においては中枢神経系において発生期における神経細胞の移動障害(migration arrest)および分化の異常や、ミエリンの低形成、PAS陽性の封入体の存在などの病理学的所見を呈する。

　このような中枢神経系の障害とペルオキシゾーム欠損によって生じる生化学的異常との関連は未だ解明されていないため、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)より確立されたペルオキシゾーム欠損変異株(Z65)を用いて対照のCHO-K1細胞の極長鎖脂肪酸・及びその他の脂質組成変化を検討したところ、グルコシルセラミド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質がZ65細胞では著明に増加し、スフィンゴミエリン等の各脂質の代謝速度も変化していた。

　このスフィンゴ糖脂質は近年、細胞の認識、増殖、分化などに際し、重要な生理学的機能を持ち、大部分のスフィンゴ糖脂質はセラミドグルコシルトランスフェラーゼによって、セラミドとUDP-グルコースから合成されるceramide monohexoside(CMH)を出発点として作られる。

　そこで、Z65細胞とCHO-K1細胞におけるセラミドグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を比較する目的で、まず同酵素のクローニングを行い、CHO-K1細胞へ過剰発現させ、クローニングした酵素の活性を測定した。さらにこの遺伝子の一部をプローブとして、ペルオキシゾーム欠損Z65細胞の遺伝子発現の変化を検討した。その結果同酵素の遺伝子は394アミノ残基からコードされており、予想される質量は45kDaと考えられた。ヒトとの相同性は塩基配列の点で92.3%、アミノ酸配列の点で98.7%であった。

　クローニングされたセラミドグルコシルトランスフェラーゼcDNAの一部をプローブとしてノーザン・ブロットを行ったところ、Z65細胞ではCHO-K1細胞と比べセラミドグルコシルトランスフェラーゼの発現が増加していた。

　クローニングされたセラミドグルコシルトランスフェラーゼを野生株へトランスフェクトし活性について検討した結果、細胞内にふくまれる生成産物であるCMHはおよそ1.5倍に増加していた。

　以上よりCMHの増加が認められたチャイニーズハムスターのペルオキシゾーム欠損変異株細胞であるZ65において、糖脂質の合成の亢進を認め、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子のZ65細胞での発現の増加を明らかにした。

　またZ65細胞における以上のような糖脂質の変化がペルオキシゾーム欠損により普遍的に生じるかどうかを明らかにするため、Zellweger症候群および乳児Refsum病の患者由来の線維芽細胞の糖脂質組成を正常細胞と比較し、スフィンゴ糖脂質の代謝変化についてもZ65細胞と同様に検討した。また同時に抗ガングリオシドGM3抗体を用いた免疫組織染色を行い細胞内GM3の検出と局在の確認を行った。

　その結果、患者由来細胞でceramide dihexoside(CDH)の軽度の増加とガングリオシドGM2、GM1、GD1aの増加を認めた。陰イオンFAB-MSや特異的抗体を用いて正常細胞に含まれないGM1やGD1aが検出されることを確認した。免疫組織染色によって患者細胞では正常細胞には認められない細胞質内に顆粒状に蓄積するGM3を見出した。GM2,GM1,GD1aはGM3から合成されるため、患者細胞では前駆体のプールが形成されていると考えられる。

　また、セリン、パルミトイル-Co-Aより始まるスフィンゴ脂質生成の各分画へ取り込まれた14Cラペルセリンの定量をすることで患者由来線維芽細胞でのスフィンゴ脂質の代謝変化を検討した。

　その結果phosphatidylserine (PS),phosphatidyl-ethanolamine (PE),sphingomyelin (SM)それぞれの分画すべてにおいて患者細胞では取り込みが増加しており、スフィンゴ脂質代謝速度の亢進が明らかになった。

　糖脂質は細胞の分化、増殖、アポトーシスに重要な生理的役割を担っていることから、患者由来細胞での糖脂質生成増加はペルオキシゾーム病の中枢神経系の病態解明に役立つ知見と考えられる。

　今後、更に患者由来の中枢神経細胞における糖脂質代謝の検討をすすめる必要がある。

　本研究は、ペルオキシゾーム病において引き起こされる糖脂質代謝異常について、その病態との関連を明らかにするため、チャイニーズハムスター由来ペルオキシゾーム欠損変異株Z65細胞および患者由来線維芽細胞株を用いて、Z65細胞において増加が報告されたスフィンゴ糖脂質の代謝の解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1. チャイニーズハムスターのサラミドグルコシルトランスフェラーゼのクローニングを行った。その結果同酵素の遺伝子は394アミノ残基からコードされており、予想される質量は45kDaと考えられた。ヒトとの相同性は塩基配列の点で92.3%、アミノ酸配列の点で98.7%であった。

2. クローニングされたセラミドグルコシルトランスフェラーゼcDNAを野生株へトランスフェクトし、活性について検討した。その結果、細胞内にふくまれる生成産物であるグルコシルセラミド(CMH)はおよそ1.5倍に増加していた。

3. クローニングされたセラミドグルコシルトランスフェラーゼcDNAの一部をプローブとしてノーザン・ブロットを行ったところ、Z65細胞では野生株であるCHO-K1細胞と比べセラミドグルコシルトランスフェラーゼの発現が亢進していた。

　Zellweger症候群2例、および乳児Refsum病患者一名から由来する線維芽細胞より脂質を抽出して、その組成の変化を正常線維芽細胞のものと比較した。その結果以下の実験結果を得た。

1. 患者由来細胞でCDHの軽度の増加とガングリオシドGM2、GM1、GDlaの増加を認めた。陰イオンFAB-MSや特異的抗体を用いて正常細胞に含まれないGM1やGDlaが検出されることを確認した。

2. 抗GM3抗体を用いた免疫組織染色を行い細胞内GM3の検出と局在の確認を行い、患者由来細胞では細胞質内のゴルジ体と予想される部位にGM3の蓄積を認めた。

3.セリン、パルミトイル-Co-Aより始まるスフィンゴ脂質生成の各分画へ取り込まれた14Cラベルセリンの定量を行った。PS,PE,SMそれぞれの分画すべてにおいて患者細胞では取り込みが増加していた。

　以上よりCMHの増加が認められたチャイニーズハムスターのペルオキシゾーム欠損変異株細胞であるZ65において、糖脂質の合成の亢進を認め、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子のZ65細胞での発現の増加を明らかにした。また、Zellweger症候群および乳児Refsum病では糖脂質組成でガングリオa系列合成経路の亢進によると考えられるガングリオシドGM2、GM1、およびGDlaの増加を認め同時にスフィンゴ脂質代謝速度の亢進を明らかにした。本論文は、これまで未知に等しかったペルオキシゾーム病の多彩な病態の原因の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。