概要:真核細胞は複製された染色体を有糸分裂によって分配し、細胞質分裂によって二つの娘細胞を生み出す。このとき遺伝情報が娘細胞に正確に受け継がれるためには、核分裂周期と細胞分裂周期が適切に連携しなくてはならない。細胞周期M期終了から細胞質分裂にかけては、特にこの連携が必要とされる。

　出芽酵母においては、姉妹染色分体をそれぞれの娘細胞に分配した後、紡錘体極(SPB、Spindle Pole Body)に局在する低分子量GTPase Tem1が活性化されることが、適切な時期にM期を終了することを可能にしている(図0)。しかし、活性化されたTem1がどのようにM期終了のシグナルを伝えるのかについては未知であった。Tem1と複合体を形成するM期終了に必須なプロテインキナーゼCdc15は、Tem1と協調してM期終了を制御している可能性が高いと考えられた。

　Tem1とCdc15の相互作用について解析を行ったところ、Tem1とCdc15の結合がM期終了に必須であり、Cdc15がTem1のターゲットであることが明らかになった。また、M期終了におけるCdc15の関連因子を探索する過程で、Cdc15の機能がM期終了のみならず細胞質分裂にも必要であることを発見した。出芽酵母Tem1/Cdc15経路は、M期からG1期への移行に際して核分裂周期と細胞分裂周期を連携させる重要なシグナル伝達経路であると考えられた。

結果と考察

Tem1とCdc15との相互作用についての解析:Cdc15のアミノ末端に存在するキナーゼドメインに隣接した、82アミノ酸からなる領域がTem1結合領域である(図1A)。部位特異的変異導入によりTem1結合領域に変異を持った変異cdc15を作製した(図1B)。cdc15-LF変異は、Tem1とCdc15の結合を減少させ、温度感受性増殖を引き起こした(図2、3A)。cdc15-LF株の温度感受性増殖は、TEM1の大量発現、あるいは活性化型TEM1(TEM1-1)の発現によって抑圧された(図3B)。特にTEM1-1によるcdc15-LF株の温度感受性の抑圧が顕著だったことから、活性化型Tem1とCdc15の結合がM期終了に必要であると考えられた。Cdc15-LFのin vitroキナーゼ活性は野生型Cdc15のそれと大きな差は見られなかった(図4)。一方、Cdc15-LFは37℃においてのSPB局在に欠損を示した(図5)。Cdc15のTem1結合領域は、Cdc15のSPBへの局在制御に関与していると考えられた。以上の結果から、M期終了において活性化されたTem1がCdc15のSPB局在を制御してM期終了を促進していることが示唆された。

M期/G1期遷移におけるCdc15の機能についての解析:M期終了におけるCdc15の関連因子を探索したところ、importin β様タンパク質をコードするKAP104の変異(kap104-rcf変異)が、cdc15-2株の温度感受性を抑圧することを発見した(図6、7)。制限温度34℃において、cdc15-2株はスピンドルを保持したままM期終期で停止した(図8)。一方、cdc15-2kap104-rcf株はスピンドルを脱重合してM期を終了し、その後DNAの再複製を行い二度目のM期へと進行したことから、kap104-rcf変異がM期終了を促進していると考えられた。34℃においては、cdc15-2kap104-rcf株は出芽周期をくり返し、数珠状の細胞になった(図8C、j)。Zymolyase処理によって細胞壁を消化しても数珠状の形態は失われないことから、cdc15-2 kap104-rcf株は細胞質分裂に欠損を示すと考えられた(図9)。これらの結果は、M期終期で停止したcdc15-2株においては、M期終了を促進するだけでは、細胞質分裂を誘導するのには十分ではないことを示している。すなわち、Cdc15はM期終了のみならず、細胞質分裂においても重要な役割をはたしていると考えられた。M期終了においてCDK(サイクリン依存性キナーゼ)インヒビターSic1の十分な発現にはSIC1の転写活性化因子Swi5が必要であり、Swi5はM期終了においてCdc15依存的に核内に蓄積することが知られている。37℃においてM期後期/終期におけるSwi5の核への蓄積は、cdc15-2株では顕著でないが、cdc15-2 kap104-rcf株では観察された(図10)。kap104-rcf変異はSwi5を核に蓄積させることでM期終了を促進していると予想された。

まとめ:姉妹染色分体が母・娘細胞のそれぞれに分配された後、活性化されたTem1がCdc15機能を高進させM期終了を指令すると考えられる。Tem1はCdc15のSPB局在の制御に関与している可能性が示唆された。cdc15変異によって引き起こされる欠損のうち、M期終了におけるものを特異的に抑圧するkap104変異を単離したことで、Cdc15はM期終了のみならず、細胞質分裂にも必要であることが明らかになった。出芽酵母においては、共通の因子Cdc15をM期終了と細胞質分裂のそれぞれにおいて使い分けるメカニズムが存在し、M期/G1期遷移を制御していると予想される。このようなメカニズムは、真核細胞がどのように核分裂周期と細胞分裂周期を連携させているのかを考える上で重要である(図11)。

図0　出芽酵母の細胞周期とM期終了制御をつかさどる因子群　G1期初期に増殖の為の環境や様々な条件が整ったことを確認して、細胞周期を開始する。

出芽によって娘細胞を成長させる一方で、S期においてDNA複製を行う。M期中期(metaphase)からM期終期(telophase)にかけて、スピンドル(緑線)により姉妹染色分体が母細胞と娘細胞へ分配される。その後、SPBに局在するTem1(赤マル)によってM期終了を制御する因子群(MEN、Mitotic Exit Network)が活性化され、細胞はM期を脱出する。母細胞と娘細胞の間で細胞質分裂が起こり、二つのG1期の細胞が生まれる。

図1　Cdc15のTem1-binding domain A.Tem1とCdc15との結合にはキナーゼドメイン(KD、黒四角)に隣接する82アミノ酸からなる領域(青四角)が必要である。

B.Tem1-binding domainのアミノ酸配列と部位特異的に変異を導入したアミノ酸残基を示した。3種類の変異cdc15 (cdc15-DD、cdc15-S309A、cdc15-LF)を作製した。下線は電荷を持ったアミノ酸残基に富んだ領域を示している。中央部のSPSK配列は、推定CDKリン酸化部位である。LxxLFxVCxL配列は分裂酵母Cdc15ホモログCdc7キナーゼにも存在する配列である。数字はアミノ末端からのアミノ酸の数を表す。

図2　cdc15-LF変異はTem1との相互作用を減少させる。

myc9His6タグを付加したTem1(Tem1-myc9His6)を発現している酵母細胞に、それぞれHAタグを付加した変異Cdc15を発現させた。それぞれの酵母破砕液から抗myc抗体を用いてTem1-myc9His6を免疫沈降させて、沈降物に含まれる変異Cdc15を抗HA抗体を用いたウエスタンブロッティング法により検出した。Tem1-binding domainの欠失変異(d82SX)やcdc15-LF変異によってTem1との結合は失われ、cdc15-DD変異によって減少した。CDC15; Cdc15-HA5, d82SX; Cdc15-d82SX-HA5, DD; Cdc15-DD, LF; Cdc15-LF

図3　cdc15-LF株は温度感受性を示し、細胞周期M期終期で増殖を停止する。

A.制限温度(37℃)におけるcdc15-LF株の表現型。フェロモン処理によって細胞周期G1期に同調させたcdc15-LF株をフェロモンの無い培地に戻し、37℃で培養した。80%〜90%の細胞(n>200)が、長く伸びたスピンドル微小管を保持したまま増殖を停止した。典型的な細胞の形態(a、c)、DNA染色像(DAPI染色、赤)、チューブリン染色像(抗チューブリン抗体を用いた間接蛍光抗体法、緑)を示した(b、d)。矢頭は、フェロモン処理によって変形した母細胞を示す。B.cdc15-LF株の温度感受性は、Tem1の活性化によって抑圧される。cdc15-LF株に4種類のプラスミドをそれぞれ導入して、制限温度(37℃)での増殖の様子を調べた。CDC15; CDC15発現プラスミド、TEM1; TEM1高発現プラスミド、TEM1-1; 活性化型変異TEM1-1発現プラスミド、vector, コントロールプラスミド

図4　Cdc15-LFのキナーゼ活性は温度感受性ではない。

A.温度感受性cdc15変異の分子内位置を示した。cdc15-rlt1変異(rlt1)はキナーゼドメイン(K)に、cdc15-LF変異(LF)はTem1-binding domain (T)に、cdc15-lyt1変異(lyt1)は機能未知の中央領域に存在する。B.Cdc15キナーゼアッセイ。HAタグを付加したCdc15を酵母細胞で発現させ、抗HA抗体によって免疫沈降させた。基質としてmyelin basic protein (MBP)を用い、25℃と37℃のそれぞれにおいて免疫沈降物に対してキナーゼアッセイを行った。MBPに付加された32P量をオートラディオグラフィによって検出した。C.Bの結果を定量してグラフ化して示した。数字は37℃と25℃におけるキナーゼ活性の比を表している。キナーゼドメインの変異が著しくキナーゼ活性を低下させるのに対して、Tem1-binding domainの変異は常温、あるいは高温においてもキナーゼ活性にそれほど影響を与えない。

図5　Cdc15-LFはSPBへの局在に欠損を示す。

Cdc15のカルボキシ末端にgreen fluorescent protein (GFP)を融合させたCdc15-GFPを酵母細胞内で大量発現させると、DAPI染色によって検出される核に接して一つないし二つのGFPの輝点が検出される(a、f)。これらの輝点は、SPBと共局在する(データは示さない)。Cdc15-LF-GFPを発現している細胞では、核周辺には明確なGFPの輝点は検出されず、著しく弱い輝点が観察されるものも存在した(c、h)。また、細胞質にGFPの輝点が検出されるものも存在した(矢頭)。キナーゼ領域の変異(rlt1、図4A参照)によって、Cdc15のSPBへの局在は失われ、細胞質のGFPシグナルが顕著になった。cdc15-lyt1変異(lyt1、図4A参照)はCdc15のSPB局在に対して顕著な影響は及ぼさなかった(d、i)。致死的な変異cdc15-DD(図1B参照、データは示さない)は、Cdc15のSPB局在を著しく促進した(e、j)。

図6　cdc15-2株の温度感受性を抑圧する変異(rcf変異)の単離　cdc15-2株を低い制限温度(34℃)下で培養し、突然変異によって増殖が可能になった株を単離した。

その突然変異をrcf変異と名付けた(revertant of cdc-fifteen)。一つの遺伝子に起こった突然変異に起因するrcf変異は4つの相補群に分類された(rcf5、rcf70、rcf114、rcf137)。25℃、34℃、37℃におけるrcf cdc15-2二重変異株の増殖の様子を示した。OD600=1の培養液を10分の1ずつ希釈して寒天培地上にスポットした。

図7　rcf137変異はimportin β様タンパク質をコードするKAP104に起こった変異である。

A.Kap104の模式図とrcf137変異の位置。Kap104はimportin β superfamilyのtransportin subfamilyに属する。importin β様タンパク質は分子全体にわたって18個のHEATリピートを保持している。rcf137変異(以降、kap104-rcf変異と呼ぶ)は12番目のHEATモチーフ内(青四角)に存在した。Ran相互作用領域を黒四角で示した。B.Kap104-rcfでは604番目のグルタミン酸残基がリシン残基に変化している。様々な生物種のtransportinの12番目のHEATモチーフの比較を示した。Sc;出芽酵母、Hs;ヒト、Dm;ショウジョウバエ、Xe;アフリカツメガエル、At;シロイヌナズナ、Ce;線虫、Sp;分裂酵母

図8　kap104-rcf変異はcdc15-2変異によるM期終期停止を解除し、核分裂周期を進行させる。

A.B.フェロモン処理によって細胞周期G1期に同調させたcdc15-2株、あるいはcdc15-2 kap104-rcf株をフェロモンの無い培地に戻し、34℃で培養した。経時的に細胞を回収し、スピンドルを一つ保持した細胞(M期後期・終期の細胞)の割合(n>200)と、DNA含量を計測し、細胞周期進行の様子を調べた。cdc15-2株がスピンドルを保持したまま停止したのに対して、cdc15-2 kap104-rcf株はスピンドルを脱重合した(A)。FACS解析によってDNA含量を測定したところ、cdc15-2株が2C含量で停止したのに対し、cdc15-2 kap104-rcf株では4C含量の細胞の割合が増加した(B)。cdc15-2 kap104-rcf株は34℃においてもM期を終了し、次のS期へと細胞周期を進行させたことがわかった。C.cdc15-2株、あるいはcdc15-2 kap104-rcf株の34℃における表現型。抗チューブリン抗体を用いた間接蛍光抗体法によりチューブリンを、DAPI染色によってDNAを可視化した。cdc15-2株は核を分配した後、スピンドルを保持したまま停止した(b、c)。この時、スピンドルは脱重合しないが、娘細胞から新たな芽を出した(a、下の細胞)。黒い矢頭はフェロモン処理を受けた母細胞を示している。その後もスピンドルを保持したまま出芽周期をくり返し、数珠状に連なった細胞になった(d、e、f)。cdc15-2 kap104-rcf株は核を分配した後、スピンドルを脱重合した(g、h、i、上の細胞)。白い矢頭はG1期に特徴的な星状体微小管構造を示している。その後、出芽と核分裂をくり返し、三つ以上の核を保持する多核で枝別れした細胞になった。写真の細胞(j、k、m)は中期スピンドルと終期スピンドルの二つを保持する多核細胞である。

図9　cdc15-2 kap104-rcf株は細胞質分裂に欠損を示す。

図8で示した実験において、回収した細胞をZymolyase処理した後、抗チューブリン抗体を用いた間接蛍光抗体法によりチューブリンを可視化し、スピンドルと細胞の形態を観察した。複数の細胞体が連なった細胞(chained or branched、図8j参照)の割合を黒四角で、母細胞、娘細胞が一つずつで一本のスピンドルを保持している細胞(dumbbell)を青マルで示した(n>200)。実験を行った140分間において、最初の母細胞と最初の娘細胞の間での分裂は観察されなかった。また、kap104-rcf変異のみでは細胞質分裂の欠損は示さなかった(データは示さない)。

図10　kap104-rcf変異はSwi5の核への蓄積を促進する。

内在性のSWI5をSWI5-myc18に置換したcdc15-2株、あるいはcdc15-2 kap104-rcf株をヒドロキシ尿素でS期に停止させ、再びヒドロキシ尿素の無い37℃の培地で培養した。経時的に回収して、抗myc抗体を用いた間接蛍光抗体法によってSwi5-myc18検出した。Swi5-myc18の核局在が検出された細胞の割合(A上)と、細胞周期進行のコントロールとしてM期後期/終期の核を保持した細胞の割合(A下)を示した(n>200)。典型的な細胞の染色像を示した(B)。a、cはSwi5-myc18(FITC融合二次抗体を使用)を、b、dはDAPI染色像を示している。C.Swi5-myc18の細胞内量を抗myc抗体を用いたウエスタンブロッティング法により検出したLane cycは25℃の非同調培養から回収したSwi5-myc18を表す。コントロールとしてCdc28のタンパク質量を示した。

図11　Tem1/Cdc15経路によって制御されるM期/G1期遷移のモデル図　姉妹染色分体が母細胞と娘細胞に分配されると、SPBに局在するTem1が活性化され、さらにCdc15を活性化してM期終了を促進する。

Kap104依存的な核・細胞質輸送経路がSwi5の核内量を制御してM期終了を阻害している可能性が考えられる。Kap104機能がCdc15によって制御されているかについては明らかではない。Cdc15はM期終了における機能とは別に、細胞質分裂においても必須な役割を果たしている。細胞質分裂におけるCdc15の制御因子あるいはターゲットは未知であるが細胞質分裂においてもTem1がCdc15の活性化因子として機能している可能性がある。M期終了と細胞質分裂において、Cdc15を順序よく活性化させるメカニズムが存在し、M期/G1期遷移の成功に貢献していると考えられる。

　本論文は出芽酵母の細胞周期M期の終了の分子機構について解析したものである。第1章では、M期終了ネットワークの一員であるTem1GTPaseの機能解析から、その標的蛋白質としてCdc15を見い出した。Cdc15上にTem1結合ドメインを同定し、その領域に突然変異を導入し、両者の結合の可能性をサポートする結果を得た。Tem1とCdc15との結合はCdc15キナーゼを活性化することはなかったことから、Tem1はCdc15の細胞内局在を制御する可能性を指摘した。第2章では、Cdc15の機能を調べる目的で、cdc15-2温度感受性株からの復帰変異体を分離し解析した。そのうちの一つに細胞質/核間の蛋白質輸送に関与する蛋白質Kap104をコードする遺伝子に生じた変異体であった。Kap104の不活性化がどのようにしてcdc15を抑圧するかについて検討を加えたところ、CDKの阻害因子SIC1の発現に必要な因子Swi5の輸送を通してCDK活性を制御し、Kap104の不活性化がcdc15変異体のM期終了を促進していることを明らかにした。以下に各章の要約を示す。

　第1章　Tem1とCdc15との相互作用についての解析:Cdc15のアミノ末端に存在するキナーゼドメインに隣接した、82アミノ酸からなる領域がTem1結合領域である。部位特異的変異導入によりTem1結合領域に変異を持った変異cdc15を作製した。cdc15-LF変異は、Tem1とCdc15の結合を減少させ、温度感受性増殖を引き起こした。cdc15-LF株の温度感受性増殖は、TEM1の大量発現、あるいは活性化型TEM1(TEM1-1)の発現によって抑圧された。特にTEM1-1によるcdc15-LF株の温度感受性の抑圧が顕著だったことから、活性化型Tem1とCdc15の結合がM期終了に必要であると考えられた。Cdc15-LFのin vitroキナーゼ活性は野生型Cdc15のそれと大きな差は見られなかった。一方、Cdc15-LFは37℃においてのSPB局在に欠損を示した。Cdc15のTem1結合領域は、Cdc15のSPBへの局在制御に関与していると考えられた。以上の結果から、M期終了において活性化されたTem1がCdc15のSPB局在を制御してM期終了を促進していることが示唆された。

第2章　M期/G1期遷移おけるCdc15の機能についての解析:M期終了におけるCdc15の関連因子を探索したところ、importin β様タンパク質をコードするKAP104の変異(kap104-rcf変異)が、cdc15-2株の温度感受性を抑圧することを発見した。制限温度34℃において、cdc15-2株はスピンドルを保持したままM期終期で停止した。一方、cdc15-2 kap104-rcf株はスピンドルを脱重合してM期を終了し、その後DNAの再複製を行い二度目のM期へと進行したことから、kap104-rcf変異がM期終了を促進していると考えられた。34℃においては、cdc15-2 kap104-rcf株は出芽周期をくり返し、数珠状の細胞になった。Zymolyase処理によって細胞壁を消化しても数珠状の形態は失われないことから、cdc15-2 kap104-rcf株は細胞質分裂に欠損を示すと考えられた。これらの結果は、M期終期で停止したcdc15-2株においては、M期終了を促進するだけでは、細胞質分裂を誘導するのには十分ではないことを示している。すなわち、Cdc15はM期終了のみならず、細胞質分裂においても重要な役割をはたしていると考えられた。M期終了においてCDK(サイクリン依存性キナーゼ)インヒビターSic1の十分な発現にはSIC1の転写活性化因子Swi5が必要であり、Swi5はM期終了においてCdc15依存的に核内に蓄積することが知られている。37℃においてM期後期/終期におけるSwi5の核への蓄積は、cdc15-2株では顕著でないが、cdc15-2 kap104-rcf株では観察された。kap104-rcf変異はSwi5を核に蓄積させることでM期終了を促進していると予想された。

　以上のように、本論文はTem1とCdc15を通してM期終了の機構の理解におおきな進歩をもたらした。公表された論文は共著であるが、実験計画およびその執行は申請者によるもので、他のものは実験補助者とアドバイザーである。以上の評価に基ずき、本研究は博士(理学)の学位に十分値するものであることが、審査委員全員の一致により認められた。