序

胃癌、大腸癌などの固形癌は、一般に抗癌剤による治療に抵抗性を示す。そのため耐性克服法の開発は、がん治療成績の向上において重要な課題となっている。固形癌の薬剤抵抗性の大きな原因として、異常な血管形成による低酸素状態やグルコース飢餓状態などの特殊な内部環境がある。実際癌細胞は、こうしたストレス環境下でトポイソメラーゼ(トポ)IIを標的とするエトポシドなど、種々の抗癌剤に耐性を示す。トポII標的抗癌剤の殺細胞作用にはトポIIαの高レベルでの発現が重要であるが、ストレス下ではトポIIαの発現量が低下し、耐性が誘導されることが示されている。さらに、このトポIIαの発現低下は、分解の亢進によるものであり、蛋白分解酵素プロテアソームの阻害剤によって抑制され、また耐性誘導も抑制されることが明らかになってきた。こうした研究などから、プロテアソームは固形癌治療の新たな標的として考えられてきており、耐性克服のための新たな阻害剤の開発が期待されている。そこで本研究において私は、新規プロテアソーム阻害剤についてストレス誘導耐性の克服作用を中心に検討した。また新たな耐性克服の標的としてヘムオキシゲナーゼ1についても検討を加えた。

方法と結果

無細胞系での新規プロテアソーム阻害剤の評価　新規プロテアソーム阻害剤としてBelactosin A(分子量369.42)とその誘導体KF33955(分子量459.55)、KF64586(分子量608.74)を用いた。まず、これらの化合物の精製20Sプロテアソームに対する阻害活性を比較した。プロテアソーム活性は蛍光基質Suc-LLVY-MCAを用い測定した。その結果、Belactosin Aが最も阻害活性が弱く、KF33955、KF64586の順に阻害活性が強くなることが明らかになった(図1)。また、HT-29細胞の核抽出液中プロテアソーム活性に対しても、同様にBelactosin A<KF33955<KF64586の順に阻害活性が強かった。

新規プロテアソーム阻害剤によるストレス誘導性耐性の抑制　新規プロテアソーム阻害剤Belactosin A、KF33955、KF64586について、ヒト大腸癌細胞株HT-29細胞を用い、ストレス下でのトポII標的抗癌剤耐性の誘導に対する影響を比較した。なお、細胞毒性については、コロニー形成法にて測定した。グルコース飢餓環境下では、通常培養条件下と比較して、エトポシドに対して耐性を示した(図2)。10μMのKF33955存在下では、この耐性誘導は顕著に抑制され、グルコース飢餓環境下においてもエトポシドに感受性を示すようになった(図2-a)。同様にトポII標的抗癌剤のドキソルビシンの耐性も顕著に抑制された(図2-b)。KF64586も同様の耐性誘導の抑制効果を示したが、KF33955と比較してむしろ弱かった。また、Belactosin Aについてはほとんど抑制効果を示さなかった。また他の癌細胞株A2780(卵巣癌)を用いても同様であった。

　次に、トポIIαの発現に及ぼす効果を比較した(図3)。グルコース飢餓環境下にあるHT-29細胞では、トポIIαの発現低下が認められるが、10μMのKF33955存在下では、プロテアソームの選択的阻害剤ラクタシスチンと同様に、この分解がほぼ完全に抑制された。上記の耐性誘導の抑制効果とよく合致して、KF64586によるトポIIα分解の抑制はKF33955に比べ弱く、Belactosin Aは分解抑制効果をほとんど示さなかった。また、低酸素によって誘導されるトポIIαの分解に対しても、やはりKF33955が最も強く抑制した。さらに、他の癌細胞株A2780を用いても、やはりKF33955による阻害活性が最も強力であった。以上より、無細胞系での結果と異なり、細胞レベルでのプロテアソーム阻害活性はKF33955が最も強く、以下KF64586、Belactosin Aの順となることが明らかになった。

　細胞レベルでのプロテアソーム阻害活性の違いをさらに確認するため、TNF-αによるNF-κBの活性化に及ぼす影響について検討した。通常、細胞内ではNF-κBは阻害蛋白IκBによって抑制されているが、TNF-α刺激によってIκBのプロテアソーム依存的な分解が誘導され、その結果NF-κBの活性化が起こることが知られている。レポーターアッセイにより検討したところ、KF33955はTNF-αによるNF-κBの活性化を濃度依存的に阻害したが、KF64586による阻害はそれに比べて弱く、またBelactosin Aはほとんど阻害しなかった。

　以上の検討の結果、細胞レベルでのプロテアソーム阻害活性においては、KF33955が最も優れていることが明らかになった。KF64586の細胞に対する活性が弱い理由については、現在のところ不明であるが、細胞内への取り込みが低いこと、培地中での安定性が低いことなどが考えられる。今後こうした点を改良することによって、より強力な阻害剤が開発されることを期待したい。

ストレス誘導性耐性のヘムオキシゲナーゼ1阻害剤による抑制　プロテアソーム阻害剤KF33955による耐性誘導の阻害について、トポIIαの分解抑制以外のメカニズムが関与しているかを明らかにするため、種々のタンパク質の発現変化を指標に検討した。その結果、耐性誘導の阻害と一致してプロテアソーム阻害剤KF33955はヘム分解酵素として知られているヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)の発現を誘導することが明らかになった。そこで、HO-1の活性阻害作用を有し強力なHO-1誘導剤として知られるZnPPを用い検討した。ZnPPは、非ストレス下においてもまたグルコース飢餓ストレス下においてもHO-1の誘導活性を示したが、ストレス下では20μM以上で顕著なHO-1誘導活性を示した(図4a)。次にストレス誘導のエトポシド耐性に対する影響を調べたところ、ZnPP(20μM)は耐性誘導を顕著に阻害することが明らかになった(図4b)。以上より、HO-1の誘導を促すことにより、ストレス誘導耐性を抑制できる可能性が示唆された。しかし、そのメカニズムについては全く未知であり、さらなる研究が必要と考える。

まとめ

本研究において私は、ストレス誘導性耐性に対する新規プロテアソーム阻害剤の評価を行い、細胞レベルにおいて効果的に耐性誘導を抑制する化合物としてKF33955を見出した。また、プロテアソーム依存的なトポIIαの分解以外の耐性メカニズムについて検討し、HO-1阻害剤ZnPPがストレスによる耐性誘導を顕著に抑制することを見出した。今後、これらの阻害剤の動物レベルでの評価や新たな阻害剤の開発、メカニズムの詳細の解明を通じ、プロテアソーム、HO-1を標的とした固形癌の薬剤耐性克服法の応用につながることが期待される。

Fig.1 プロテアソームの活性阻害

Fig.2 KF33955(KF2)によるストレス誘導耐性の抑制

Fig.3 プロテアソーム阻害剤によるtopo II分解の抑制

Fig.4a ZnPPによるHO-1の発現誘導

Fig.4b ZnPPによるストレス誘導耐性の抑制

　本研究は、臨床上重大な問題となっている固形癌の薬剤耐性についてその克服法の開発を目指し、固形癌内部にみられるストレスによって誘導される抗癌剤耐性に対する新規プロテアソーム阻害剤の耐性克服作用を検討し、さらに新たな耐性克服の分子標的としてヘムオキシゲナーゼ1についても検討を加え、下記の結果を得ている。

1.新規プロテアソーム阻害剤としてBelactosin A(分子量369.42)とその誘導体KF33955(分子量459.55)、KF64586(分子量608.74)を用い、これらの化合物の精製20Sプロテアソームや癌細胞の核抽出液中プロテアソーム活性に対する阻害活性を比較した。その結果、Belactosin Aが最も阻害活性が弱く、KF33955、KF64586の順に阻害活性が強くなることが明らかになった。

2.Belactosin A、KF33955、KF64586について、ヒト大腸癌細胞株HT-29、卵巣癌株A2780細胞を用い、ストレス下でのトポイソメラーゼ(トポ)II標的抗癌剤耐性の誘導に対する影響を比較した。グルコース飢餓環境下では、通常培養条件下と比較し、エトポシドに対して耐性を示した。10μMのKF33955存在下では、この耐性誘導は顕著に抑制され、グルコース飢餓環境下においてもエトポシドに感受性を示すようになった。同様にトポII標的抗癌剤のドキソルビシンの耐性も顕著に抑制された。KF64586も同様の耐性誘導の抑制効果を示したが、KF33955と比較して弱かった。また、Belactosin Aはほとんど抑制効果を示さなかった。

3.次に、トポIIαの発現に及ぼす効果を比較した。グルコース飢餓環境下にあるHT-29細胞やA2780細胞では、プロテアソーム依存的な分解の亢進により、トポIIαの発現低下が認められるが、10μMのKF33955存在下ではこの分解がほぼ完全に抑制された。上記の耐性誘導の抑制効果とよく合致して、KF64586によるトポIIα分解の抑制はKF33955に比べ弱く、Belactosin Aは分解抑制効果をほとんど示さなかった。また、低酸素によって誘導されるトポIIαの分解に対しても、やはりKF33955が最も強く抑制した。以上より、無細胞系での結果と異なり、細胞レベルでのプロテアソーム阻害活性はKF33955が最も強く、以下KF64586、Belactosin Aの順となることが明らかになった。

4.細胞レベルでのプロテアソーム阻害活性の違いをさらに確認するため、TNF-αによるNF-κBの活性化に及ぼす影響について検討した。通常、細胞内ではNF-κBは阻害蛋白IκBにて抑制されているが、TNF-α刺激によってIκBのプロテアソーム依存的な分解が誘導され、その結果NF-κBの活性化が起こることが知られている。レポーターアッセイにより検討したところ、KF33955はTNF-αによるNF-κBの活性化を濃度依存的に阻害したが、KF64586による阻害はそれに比べて弱く、またBelactosin Aはほとんど阻害しなかった。以上の検討の結果、細胞レベルでのプロテアソーム阻害活性においては、KF33955が最も優れていることが明らかになった。

5.プロテアソーム阻害剤KF33955による耐性誘導の阻害についてトポIIαの分解抑制以外のメカニズムが関与しているかを検討し、耐性誘導の阻害と一致してヘム分解酵素として知られているヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)の発現を誘導することを見い出した。そこで、HO-1の活性阻害作用を有し強力なHO-1誘導剤として知られるZnPPを用い検討したところ、ZnPPはストレス誘導のエトポシド耐性を顕著に阻害することが明らかになった。

6.ZnPPの耐性克服機序を明らかにするため、HO-1cDNAを癌細胞にトラスフェクションした。その結果、HO-1の過剰発現により、グルコース飢餓や低酸素によって誘導されるアポトーシスに高感受性化することが明らかになった。この結果とよく一致して、低酸素に感受性の白血病U937細胞では、低酸素誘導のアポトーシスに伴いHO-1が誘導されるが、低酸素耐性のUh30細胞では誘導されないことを見い出した。

　以上、本論文は、固形癌内部にみられるストレスによって誘導される抗癌剤耐性に対し、新規プロテアソーム阻害剤KF33955が有効であることを明らかにした。また、プロテアソーム依存的なトポIIαの分解以外の耐性機序についても検討し、HO-1誘導剤ZnPPがストレスによる耐性誘導を抑制することを明らかにした。本研究は、固形癌の薬剤耐性の克服に貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。