要旨

　モロニーマウス白血病ウイルス(moloney murine leukemia virus、以下MLVと略)は、スプライスされないmRNAは、ゲノムRNAとしてビリオン(virion)にパッケージされかつ、GagとPolのmRNAとしても使われる。スプライスされたmRNAはEnvをコードする。MLVが複製されるためには、スプライスされたmRNAとスプライスされないmRNAが、適切な比で産生されなければならない。一般に細胞では、イントロンを含んだスプライスされないmRNAは、核から細胞質に輸送されないため、細胞質には発現しない。MLVには、スプライスされないmRNAを発現するための仕組みがあると考えられる。Mason-Pfizer monkey virusやRous sarcoma virusで、核−細胞質移行、いわゆるconstitutive transport element(以下CTEと略)が報告されているが、MLVにおいてはこの点は明らかにされていない。

　今回、MLVのスプライスアクセプター(splice acceptor、以下SAと略)であるヌクレオチド(nucleotide、以下ntと略)5491の上流、nt 5119から5355までの237塩基領域が、MLVにおいてスプライスされないmRNAの発現を促す正のシス因子であり、gag領域のnt 1560から1906までの347塩基領域はスプライスされないmRNAの発現を抑制する、負のシス因子であることを明らかにした。正のシス因子は負のシス因子が存在する時にのみ、スプライスされないmRNAの発現を促す作用を持つことより、負のシス因子は、スプライスされないmRNAの発現が正のシス因子に依存するようにさせることを明らかにした。

材料と方法

　MLVのpo1領域2.4kbを欠失してgagとenvをコードする変異プロウイルス(GE6.4)、更にpo1-env領域をほぼ全欠失して主にgag遺伝子だけをコードする変異プロウイルス(G3.6)、及びG3.6のgag遺伝子下流にSAの上流領域を種々の長さでつなげたプロウイルス、G3.6のgag遺伝子を部分欠失したプロウイルスを調製した。全てのプロウイルスの3'LTRの下流にhygromycinB(以下hygと略)耐性遺伝子もしくは、neomycin(以下neoと略)耐性遺伝子が挿入されている。これらのプロウイルスをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、ノーザンブロットにてmRNAの発現を解析した。ウイルスmRNAの検出には3'LTRをプローブとして用いた。薬剤耐性遺伝子の発現量に対するウイルスmRNAの発現量の比を計算し、ウイルスmRNAの発現量を定量化し、変異プロウイルス間のmRNA発現量を比較検討した。

結果

　GE6.4は、スプライスされたmRNAとスプライスされないmRNAを、野生株と同程度に発現する。一方G3.6は、スプライスされたmRNAは発現せず、スプライスされないmRNAもGE6.4の1/10ほどである。このG3.6のgagの3'側にSAの上流nt 4894-5481までの588塩基領域をつなぐと、スプライスされないmRNAのみがGE6.4と同程度に発現することが示された。この588塩基領域の5'側及び、3'側領域を削ってmRNA発現に必要な領域を調べると、nt 5119-5355までの237塩基領域のみをつなぐだけで、GE6.4と同程度にスプライスされないmRNAを発現した。これよりこの237塩基領域は、正のシス因子であることが示された。この237塩基領域に塩基置換を導入すると、スプライスされないmRNAの発現が低下した。

　G3.6のgag領域から、nt 1035-2120までの1086塩基領域を欠損させると、スプライスされないmRNAの発現が上昇した。欠損させる領域を狭めたところ、nt 1560-1906までの347塩基領域のみの欠損で、スプライスされないmRNAの発現が上昇した。これよりこの347塩基領域は、スプライスされないmRNAの発現を抑制する、負のシス因子であることが示された。

　次に今回同定された正のシス因子と負のシス因子の相互作用について調べた。G3.6のgag領域よりnt 1560-1906までの347塩基領域を欠損させると、スプライスされないmRNAの発現が上昇し、再びgag領域の3'末端に347塩基領域をつなぐと、スプライスされないmRNAの発現は低下した。さらにnt 5119-5355までの237塩基領域をつなぐと、再びmRNAの発現は上昇した。G3.6のgag領域より負のシス因子の一部である、nt 1663-1906までの244塩基領域を欠損させると、スプライスされないmRNAの発現が上昇するが、さらに正のシス因子であるnt 5119-5355までの237塩基領域をつないでも、さらにスプライスされないmRNAの発現は上昇することはなかった。これより正のシス因子は負のシス因子が存在する時にのみ、負のシス因子の働きを相殺してスプライスされないmRNAの発現を促していると考えられる。

　さらに今回同定した正と負のシス因子が、MLV以外の遺伝子発現にも機能するか調べた。G3.6のgag領域をneo耐性遺伝子に置き換えた。このneo耐性遺伝子の下流に、さらに正の因子や負の因子をつないでも、mRNAの発現量は変化せず、高値を示した。これより今回同定した2つのシス因子は、MLVにおいてのみmRNA発現調節機能を発揮すると考えられる。

考察

　マウス白血病ウイルスのスプライスされないmRNA (gag mRNA)を高発現するために、スプライスアクセプターの372塩基上流から136塩基上流までの237塩基配列(nt 5119-5355)が、正のシス因子として働いていることを示した。またgag領域のnt 1560からnt 1906までの347塩基はmRNAの発現を抑制する負のシス因子として働いていることを示した。レトロウイルスの複製には、EnvメッセージであるスプライスされたmRNAと、Gag/Polのメッセージであると共にウイルスゲノムともなるスプライスされないmRNAとが、適正な量比で発現する必要がある。今回同定したgag領域とpol領域の遺伝子の相互作用により、mRNAの発現量調節が行われている可能性がある。これらのシス因子は、ネオマイシン耐性遺伝子の発現には影響せず、MLVにのみ特異的に働いている可能性がある(neo耐性遺伝子自身がCTEを持っている可能性もある)。

　今回調製したプロウイルスは、転写にMLV-LTRの共通のプロモーター−エンハンサーを用いており、調製されたプロウイルスのクローン間で、転写レベルはほとんど同じであるので、転写開始効率はどのMLV変異株でも同じであると考えられる(Odawara et al., J. Virol., 72:54145424)。一方大島らは、SA上流を欠損したMLVでは、スプライスされないmRNAの核−細胞質輸送又は、核内での安定性が減少している可能性を示唆しているので(Oshima et al., J. Virol., 70:2286-2295)、237塩基領域はCTEとして働いている可能性がある。このシス因子への結合タンパク質を同定することにより、MLV特有の核から細胞質への輸送経路を明らかにすることができると期待され、ベクターやウイルスワクチン開発への応用も期待される。

　本研究はモロニーマウス白血病ウイルス(MLV)において、スプライスされないmRNAの発現に関わる遺伝子領域を明らかにするため、MLV変異プロウイルスを用いてノーザンブロットによるRNA発現量の解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1.野生株よりの欠損実験より、スプライスアクセプター(splice acceptor, SA)nt 5491の上流のnt 5325-5390領域が、スプライスされないmRNAの発現に重要であることが示唆されていたが、領域を特定するに至っていなかった。今回polとenvをほとんど欠損させて、gagのみをコードするMLV変異プロウイルスG3.6にSAの上流領域を挿入し、ノーザンブロットによりRNA発現を調べた。その結果nt 5119-5355の237塩基領域は、MLVにおいてスプライスされないmRNAの発現を促す正のシス因子であることが示された。

2.G3.6のgagをネオマイシン耐性遺伝子に置き換えると、スプライスされないmRNAの発現が上昇した。これよりgag領域内にスプライスされないmRNAの発現を抑制する領域が存在することが示唆された。そこでG3.6のgag領域を様々に欠損させた変異株を調製し、ノーザンブロットによりRNA発現を調べた。その結果nt 1560-1906の347塩基領域は、MLVにおいてスプライスされないmRNAの発現を抑制する負のシス因子であることが示された。

3.G3.6を用いて、正のシス因子と負のシス因子の欠損、挿入実験を行ったところ、正のシス因子は負のシス因子が存在するときにのみ、スプライスされないmRNAの発現を促すことが示され、正のシス因子は負のシス因子の働きを相殺することが示された。これより正のシス因子と負のシス因子の相互作用により、スプライスされないmRNAの発現が調節されていると考えられた。これらのシス因子は、置かれる位置に関係なく機能を発揮することが示された。

4.G3.6のgagをネオマイシン耐性遺伝子に置き換えた後、正や負のシス因子をつないでみたが、RNAの発現に変化はみられなかった。ネオマイシン耐性遺伝子自身が、constitutive transport element (CTE)を持っているという可能性もあるが、実験事実を単純に解釈すると、これらのシス因子はMLVにおいてのみ、特異的に機能している可能性が示された。

5.これらのシス因子の作用機構については、核内でのRNA安定性や、CTEの可能性、スプライシングを抑制している可能性が考えられる。しかしコンピュータープログラムを用いたRNA二次構造予測より、CTEとして働いている可能性が示唆された。

　以上、本論文はモロニーマウス白血病ウイルスにおいて、変異プロウイルスを用いたノーザンブロット解析から、スプライスされないmRNAの発現に関わる正と負のシス因子を明らかにした。レトロウイルスにおいて、スプライスされないmRNAの発現に関わる因子は、ヒト免疫不全ウイルスや、D−タイプレトロウイルスなど、わずかな報告例しかない。本研究はこれまで全く未知であったスプライスされたmRNAとスプライスされないmRNAの発現バランスの調節解明の糸口となり、ウイルスワクチン開発等臨床応用の可能性もあり、学位の授与に値するものと考えられる。