peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)は、nuclear hormone receptor superfamilyに属し、ligand結合により転写因子として作用する。PPARにはα, δ, γの3種のisoformがあり、それぞれretinod X receptor(RXR)とheterodimerを形成、ligandと結合することによりDNA binding site(PPRE)に結合、下流遺伝子の転写を活性化する。PPARγはadipocyteに高発現し、脂質代謝酵素geneを誘導することが知られているが、colon mucosaでも比較的高発現を示しており、また、colon polyp, colon cancerにても高発現が認められる。PPARγの内因性のligandとしては、15-Deoxy-12, 14-prostaglandin J2が存在する。PPARγの外因性のligandとしてはfibrate, thiazolinidedione(Troglitazone, BRL49653(=Rosiglitazone), Pioglitazone)等が存在する。thiazolinidedioneにはinslin感受性を高める作用があり、2型糖尿病に臨床応用されている。

　これまでに、colon cancerを始め、PPARγ ligandの種々のcancer cellに対する細胞増殖抑制効果の報告があるが、そのpathwayについては明らかではない。今回PPARγの特異的ligandであるBRL49653によるcolon cancer cellであるHCT116への細胞増殖抑制誘導時におけるgene expressionの経時的変化をcDNA microarrayを用いて解析を行った。

　colon cancer各種cell lineにおいてNorthern blottingにてPPARγ gene expressionが、また、Western blottingにてPPARγ proteinの存在が確認された。colon cancer cell lineであるHCT116にBRL49653を20μM投与し、cell countにて24hourからの増殖抑制効果が確認され、fluorescence activated cell sorting assayにより12hourよりG1 arrestが確認された。また、luciferase reporter assayにてBRL49653によりPPARγがactivateされていることが確認された。

　BRL49653 20μMをHCT116に加え、1hour, 3hour, 6hour, 12hour, 24hourでtotal RNAを抽出、これをCy5でlabelし、time 0で抽出したtotal RNAはCy3でlabelし、これをcontrolとし、microarrayへのhybridizationを行った。解析の結果、時間経過とともにCy5/Cy3の比(fold induction)が2以上または1/2以下のものが増加することが確認され、24hourにてfold inductionが2以上のgeneは32個、0.5以下のものは75個存在した。12hourにてG1 arrestが確認されていることから、少なくとも12hourからのexpressionの持続的変化が細胞増殖抑制に影響を与えるものと考え、12hourおよび24hourでfold inductionが2以上または0.5以下のものをlist upし、fold inductionが2以上のものは18gene、fold inductionが0.5以下のものは6gene存在した。fold inductionが2以上のgeneのうち細胞増殖抑制作用のあるものは5gene(early growth response 1, immediate early response 3, prostate differentiation facror, B-cell translocation gene 1, cyclin G2)存在し、これらのうち4geneは6hourよりexpressionの上昇が認められた。

　cDNA microarrayのdataを検証するために、同じtotal RNAを使用して上記5geneにつきRT-PCRを施行、結果はmicroarrayのdataと一致した。また、dose dependentにexpressionの増加が確認された。

　RB patyway cell cycle component geneについてはcDNA microarrayにおけるsignal intensityがthreshold以下のものが多かったため、expressionの変化を確認するため、各geneに対しRT-PCRを施行、E2F1, E2F2, E2F3, DP1で12hourよりgene expressionの低下がみられ、24hourではほぼ消失しており、このことが直接細胞増殖抑制およびG1 arrestに影響を与えているものと考えられた。

　今回PPARγの特異的ligandであるBRL49653によるcolon cancer cell lineへの細胞増殖抑制誘導時のgene expressionの変化をcDNA microarrayを用いて解析した。細胞増殖抑制に先行して細胞増殖抑制作用のあるearly growth response 1, immediate early response 3, prostate differentiation facror, B-cell translocation gene 1, cyclin G2のexpressionの持続的上昇が認められた。また、RT-PCRによりE2F1, E2F2, E2F3, DP1などcell cycle component geneのexpressionの低下が上記geneのexpressionの上昇に遅れて認められたが、このことが直接細胞増殖抑制に関係していると考えられた。

　これらのことより、PPARγ ligandによりtranscriptionの誘導されたanti-proliferative geneがcell cycle component geneのtranscription抑制に影響を与えている可能性が示唆された。

　本研究はPPARγ ligandによるcolon cancer cellへの細胞増殖抑制効果のtranscription levelでのpathwayを明らかにするために、colon cancer cell lineであるHCT116にPPARγ特異的ligandであるBRL49653を作用させることにより細胞増殖抑制を誘導し、その際のgene expressionの変化をcDNA microarrayを用いて経時的かつ網羅的解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1.HCT116にBRL49653を0, 5, 10, 20μM添加後12hourにてはcell countには差が認められなかったが、24hourより各濃度にて有意差が認められた。また、FACSの結果にて、BRL49653を20μM添加したものでは12hourよりG1-S transition inhibitionが認められた。BRL49653を20μM添加したものでは12hourの時点で細胞増殖抑制が生じていることが示された。

2.HCT116に対し、Firefly luciferase vectorにrat acyl-CoA oxidase gene上流に存在するPPREを2個組み込んだものを使用しluciferase reporter assayを行ったところ、BRL49653を20μM添加したものでは0μMのものと比較し2.9倍の活性を示し、PPARγがBRL49653添加により転写因子として作用していることが示された。

3.HCT116にBRL49653を0, 5, 10, 20μM添加後1, 3, 6, 12, 24hourにてtotal RNAを抽出し、このうち20μM添加したものにつきin-vitro transcriptionによりCy5でlabelし、time 0で抽出したtotal RNAはCy3でlabelし、それぞれのexpressionの比(Cy5/Cy3=fold induction)をcDNA microarrayを用い解析した。12hour, 24hourにおいて持続的にfold induction 2以上の変化を示すgeneは18、fold induction 0.5以下の変化を示すgeneは6存在した。fold induction 2以上の変化を示したものの中で細胞増殖抑制作用を有するものが5gene (early growth response 1, immediate early response 3, prostate differentiation facror, B-cell translocation gene 1, cyclin G2)存在することが示された。これらのうち4geneは6hourよりexpressionの上昇が認められた。この5geneは上記total RNAを用いたRT-PCRにてもcDNA microarrayを同様の結果になっていること、また、BRL49653のdose dependentにexpressionが強くなることが確認された。

4.RB pathway cell cycle component geneについてはcDNA microarrayにおけるsignal intensityがthreshold以下のものが多かったため、3.と同じtotal RNAを用いてRT-PCRを行った。12hourよりE2F1, E2F2, E2F3, DP1のexpressionが低下し、また、24hourにてはexpressionがほぼ消失していることが示された。

　以上、本論文はcolon cancer cellであるHCT116においてPPARγ ligandによりtranscriptionの惹起される細胞増殖抑制に関与するgeneを、cDNA microarrayによる解析により明らかにした。また、細胞増殖抑制がE2F1, E2F2, E2F3, DP1のexpressionの低下によることも明らかにした。本研究はこれまで明らかにされていなかったPPARγ ligandにる細胞増殖抑制のpathwayの解明に重要な貢献をなすものと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。