【背景】

　Porphobilinogen Deaminase(PBGD)はヘム合成経路の第3番目の酵素で、alternative splicingによるerythroid typeとhousekeeping typeの2種類の表現型が知られている。erythroid typeはerythroid系細胞のみで発現しているが、housekeeping typeは各種臓器に発現していると考えられ、近年、定量的RT-PCR法のコントロール遺伝子として用いられている。

　housekeeping typeのPBGDは急性間欠性ポルフィリア(acute intermittent porphyria,AIP)の原因遺伝子であることが知られている。急性ポルフィリアはヘム合成経路の関連酵素の中で一つ以上の酵素活性の異常に起因するものと定義されている。これまで急性ポルフィリアの責任臓器は肝臓とされ、原因関連酵素の研究は肝臓を中心に行われていたが、急性発作時に増加する尿中のポルフィリン代謝物が腎臓由来と考えられるなど、腎臓におけるポルフィリンの代謝異常の関与を示唆する知見も得られている。しかし、腎臓におけるPBGDの生理機能及びAIPの病因との関連はまだはっきり知られていない。

　本研究で我々は定量的RT-PCR法を用い、各ネフロンセグメントにおけるPBGD mRNA発現を検討した。また、腎臓、肝臓の組織のhomogenateを用いて、PBGDの酵素活性を測定し、mRNA量と比較検討した。

【方法】

1.核酸の取得

　正常6〜8週齢のSDラットを用いて、ネフロンセグメントはマイクロデイセクションによって得た。得られたネフロンセグメントはグアニジンにて細胞を変性させ、直接エタノール沈澱により核酸を得た。

　腎臓および肝臓の組織homogenateでのmRNAの測定では、少量の組織片(10-6リットル程度)をマイクロディセクションにより分離し、グアニジン下で均質化しphenol-chloroform法とエタノール沈殿によって核酸を抽出した。

2.MRT-PCR法

　mRNAの定量には共著者の谷口らが報告したMutagenic RT-PCR法(MRT-PCR法)(Taniguchi S et al., Am J Physiol 266(C35):C1453-C1458,1994)を更に改良した方法を用いた。その基本原理はCompetitive PCRと同様にターゲットとコントロールを同一チューブ内で同一プライマーを用いて平行して増幅する。但しコントロールとしてCompetitive PCRでは、人工の核酸をターゲットに加えるが、我々は組織由来のゲノムDNAをそのままコントロールとして用いている。このため組織量の定量やRNAの抽出といった過程は必要なく、極めて簡便に細胞あたりのmRNA量の定量が可能となった。

　この方法を具体的に説明する。まず、組織から得られた核酸より特異的なRTプライマーを用いて逆転写反応を行いcDNAを合成する。この特異的なRTプライマーによりcDNAに42塩基対のdeletionが導入された。

　このRTプライマーがPCRの段階に残存しておりゲノムDNAと反応するとゲノムDNAにも同様のdeletionが導入され疑陽性の結果をもたらす可能性がある。この事を防止するため、我々はuracyl-DNA glycosylase (UDG)システムを用いた。RTプライマーのT残基をU残基に入れ替え、UDGにより分解されるようにし、PCRの前にサンプルをUDGと反応させ、過剰なRTプライマーを除去した。

　ゲノムDNA相同配列をcDNAと平行に増幅させるため、二つのPCRプライマーは同一エキソン上に選んだ。PCRサイクルはdenaturing 94℃で40秒間、アニリング60℃で40秒間、extension72℃で20秒間で行った。40サイクルのPCRの後、サンプルはacrylamideゲル電気泳動法によって分析した。PCR産物の長さはcDNA由来のものは109bpで、ゲノムDNA由来のもの151bpで、PCR産物の量はバンドの強さをdensitometerで測定し評価した。細胞あたりのmRNA量はこの2種類のPCR産物の量の比(CG比)として示した。

3.PBGD活性の測定

　採取された組織を0.25M sucrose溶液の中でhomogenate化し、遠心後上清を収集した。0.7mlのこの上清と0.2mlのPBG(0.6mM)をNa-phosphate buffer(0.38M, pH7.8)の中で混合し、遮光環境下37℃で60分間インキュベートさせてから、0.6% iodineを含む0.5MTCAを0.1mlを加え、反応を中止させた。サンプルを遠心後上清を収集し、蛍光分光計で合成されたuroporphyrin I(URO)の蛍光測定を行った。励起波長と放出波長はそれぞれ405nmと597nmであった。酵素活性はURO(pmol)/組織量(mg)/時間(h)で示した。

【結果】

　MRT-PCR法を用い、それぞれのネフロンセグメントにおけるPBGD mRNAの定量分析を行った。各尿細管セグメントにおけるPBGD mRNAの発現(近位曲尿細管4.53±0.32、近位直尿細管5.13±0.52、Henle係蹄太い上行脚髄質部5.71±0.25、Henle係蹄太い上行脚皮質部5.29±0.20、遠位曲尿細管4.05±0.35、集合管皮質部2.88±0.25、集合管髄質外層4.90±0.24、値はCG比、平均値±標準誤差で示している)は糸球体(1.04±0.10)と比べ高値であることが示された。肝臓でのPBGD mRNA発現(3.17±0.36)は糸球体より高値ではあるが、大多数の尿細管セグメントのmRNAの発現量には及ばなかった。

　糸球体と尿細管セグメントにおけるPBGD mRNAの発現量の違いが検査法による人為的な誤りでない事を確認するため、β-actinのmRNAをPBGDと同様の方法で定量した。β-actinのCG比は糸球体と近位曲尿細管でそれぞれ17.8と23.8とほぼ同程度であったが、PBGDではそれぞれ0.79と5.18と大きな差をしめした。

　腎臓および肝臓の組織PBGD酵素活性も測定し、それをmRNA量と比較した。各組織で測定したPBGD酵素活性(URO pmol/mg/h、平均値±標準誤差)はそれぞれ腎臓髄質内層5.54±0.89、髄質外層13.26±0.95、皮質14.33±0.60、肝臓17.57±2.34であった。PBGD mRNAレベル(平均値±標準誤差)はそれぞれ腎臓髄質内層0.88±0.08、髄質外層2.08±0.29、皮質2.36±0.33、肝臓3.17±0.36であった。PBGDの酵素活性とmRNAレベルと強い相関を示した。

【結論】

　腎尿細管でPBGD mRNAが多量に発現していることはこれらの細胞でのPBGDの活性が高く、ヘム合成が活発であることを示唆する。

　本研究は腎におけるPBGDの役割を明かにするため、新しく開発した定量的RT-PCR法を用い、各ネフロンセグメントにおけるPBGD mRNA発現を検討した。また、腎臓、肝臓の組織のhomogenateを用いて、PBGDの酵素活性を測定し、mRNA量と比較検討した。下記の結果を得ている。

1.MRT-PCR法を用い、それぞれのネフロンセグメントにおけるPBGD mRNAの定量分析を行った結果、各尿細管セグメントにおけるPBGD mRNAの発現(近位曲尿細管4.53±0.32、近位直尿細管5.13±0.52、Henle係蹄太い上行脚髄質部5.71±0.25、Henle係蹄太い上行脚皮質部5.29±0.20、遠位曲尿細管4.05±0.35、集合管皮質部2.88±0.25、集合管髄質外層4.90±0.24、値はCG比、平均値±標準誤差で示している)は糸球体(1.04±0.10)と比べ高値であることが示された。肝臓でのPBGD mRNA発現(3.17±0.36)は糸球体より高値ではあるが、大多数の尿細管セグメントのmRNAの発現量には及ばなかった。

2.糸球体と尿細管セグメントにおけるPBGD mRNAの発現量の違いが検査法による人為的な誤りでない事を確認するため、β-actinのmRNAをPBGDと同様の方法で定量した。β-actinのCG比は糸球体と近位曲尿細管でそれぞれ17.8と23.8とほぼ同程度であったが、PBGDではそれぞれ0.79と5.18と大きな差をしめした。

3.腎臓および肝臓の組織PBGD酵素活性も測定し、それをmRNA量と比較した。各組織で測定したPBGD酵素活性(URO pmol/mg/h、平均値±標準誤差)はそれぞれ腎臓髄質内層5.54±0.89、髄質外層13.26±0.95、皮質14.33±0.60、肝臓17.57±2.34であった。PBGD mRNAレベル(平均値±標準誤差)はそれぞれ腎臓髄質内層0.88±0.08、髄質外層2.08±0.29、皮質2.36±0.33、肝臓3.17±0.36であった。PBGDの酵素活性とmRNAレベルと強い相関を示した。

　以上、本論文は著者らの開発したMRT-PCR法と酵素活性を測定することにより著者らは各ネフロンセグメントにおけるPBGD mRNA発現量を明かにし、腎尿細管でPBGD mRNAが多量に発現していることを発見した。この点から学位論文として相応しい内容と考えられる。