はじめに

　1980年にFurchgottらは、内皮を擦過しない血管においてアセチルコリンによる血管弛緩反応が生じたことを観察し、アセチルコリンにより内皮から未知の物質が産生され、血管平滑筋を弛緩させるという結論に達し、それを内皮由来弛緩因子endothelium derived relaxing factor (EDRF)と名付けた。アセチルコリンなどの液体因子やshear stressなどにより、内皮細胞におけるNO産生が増加し、産生されたNOは血管平滑筋細胞に作用し、soluble guanylate cyclase活性化を介して細胞内のcyclic GMPレベルを上昇させ、血管平滑筋を弛緩し血管を拡張させる。その他、NOは平滑筋細胞増殖の抑制、血小板の接着、凝集抑制などの作用がある。

　一方、NOSの活性を阻害する内因性物質としてNG-monomethylarginine (LNMA)およびasymmetric dimethylarginine (ADMA)が同定された。ADMAは尿中に排泄されるだけでなく、dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH)により、シトルリンとジメチルアミンに加水分解される。

　心血管疾患における、NOの重要性が認識されるに伴い、NOSの活性を調節すると考えられているADMAおよびDDAHの生理的ないし病態における役割の検討が必要である。

　本研究においては、以下の3つの項目について検討を行った。

研究1　内皮依存性血管拡張反応と血中ADMA濃度の検討

研究2　血管平滑筋細胞脱分化とDDAHの発現

研究3　各種病態モデルラットにおける血中ADMA濃度およびDDAH発現の検討

研究1

<背景・目的>　動脈硬化の早期病変として、血管内皮細胞の機能異常があり、障害をもつ血管内皮細胞はNOの産生および放出が減少し、内皮依存性血管拡張反応が低下するといわれている。一方、ADMAは、動脈硬化危険因子を有する患者では、血中濃度が上昇することより、Risk Factorによる血管内皮機能低下の一因になっている可能性がある。

　他の動脈硬化の危険因子として睡眠時無呼吸症候群sleep apnea syndrome (SAS)が注目されており、これまで内皮依存性血管拡張反応の低下が報告されているが、血中ADMA濃度の検討はなされていない。そこで、本研究では、睡眠時無呼吸症候群の病態を改善するとされているnCPAP療法の影響を検討した。

<方法>　睡眠時無呼吸症候群(OSAS)で持続陽圧呼吸療法(nCPAP)を開始した患者において、内皮依存性血管拡張反応(%FMD)、内皮非依存性血管拡張反応(%NTG)と血中ADMAおよびNOx濃度を測定した。

<結果>　OSAS患者の%FMDは、治療により有意に改善を示し、%NTGは、一定の変動を認めなかった。一方、血中ADMA濃度は、低下する傾向を認め、治療前後における%FMDと血中ADMA濃度が逆相関(p<0.05)を示した。NOxは、%FMDが改善するに伴い、増加傾向が認められ、%FMDとNOxは正相関関係にあった。

<考察>　睡眠時無呼吸症候群において、血中ADMA濃度と血管内皮機能が逆相関することが示されており、nCPAP後の血管内皮機能の改善において血中ADMA濃度の低下が重要な機序の一つである可能性がある。

研究2

<背景・目的>　血管平滑筋細胞は、動脈硬化の危険因子により、脱分化し合成型となり新生内膜において増殖すると考えられている。このように血管平滑筋細胞のフェノタイプ変換(phenotypic modulation)は、血管病変形成において大きな役割を果たしている可能性がある。前項で、血管内皮機能異常と血中ADMA濃度に相関が認められることが示されたが、このADMAを加水分解する酵素DDAHの新生内膜における役割は全く知られていない。そこで、本研究では、血管平滑筋細胞の脱分化とDDAHの発現の相関を検討した。

<方法>　頸動脈バルーン傷害モデルにおける免疫染色およびIGF-I、PDGF-BB、およびserumによって脱分化度を調節した培養血管平滑筋細胞におけるDDAHの発現をノーザンブロット法およびウエスタンブロット法にて検討した。

さらに、培養血管平滑筋細胞上清中のADMA濃度も検討した。

<結果>　頸動脈バルーン傷害モデルの肥厚した内膜の細胞成分と一致してDDAH I、IIの発現が認められた。さらに、培養血管平滑筋細胞の脱分化度を軽減するIGF-1刺激により、DDAHの発現減少を認め、一方、脱分化度を促進するとされているPDGF-BBおよび血清刺激によりDDAHの発現亢進を認めた。培養血管平滑筋細胞上清中のADMA濃度は、PDGF-BB刺激により減少した。これは、PDGF-BB刺激による細胞内のDDAH Iの増加による可能性がある

<考察>　肥厚した新生内膜の血管平滑筋細胞において、DDAH IおよびDDAH IIの発現の上昇を示した。さらに、本研究では、脱分化の程度をmodulateする系として、IGF-1、PDGF-BBおよび血清を培養血管平滑筋細胞に添加し、脱分化にともなう血管平滑筋細胞のDDAH IおよびDDAH IIの発現増加を認めた。これらのDDAHの増加は、病変部位におけるADMA濃度を低下させ、局所のNOの量を増加させ、内膜肥厚に拮抗的に作用する可能性がある。

研究3

<背景・目的>

　研究1で述べたように、血管病変進展と深く関わる加齢、高血圧、糖尿病などの動脈硬化危険因子を有する患者では、ADMAの血中濃度が上昇していることが報告されている。各種病態におけるADMAの血中濃度上昇の機序の解明のみならず、危険因子の治療(一次予防)が血中ADMA濃度にどのように影響するかをモデル動物を用いて検討した。

<方法>

　雄性SHRラットにHydralazine、Candesartan (TCV-116)を投与した降圧モデルラットおよび雄性WKYラットにDOCA+1%食塩水、Angiotensin IIを投与した昇圧モデルラットにおいて、血中ADMA濃度を測定した。また、血管壁におけるDDAHの発現に関しても検討した。

<結果>　降圧モデルラットにおいて、血中ADMA濃度に有意差を認めなかった。昇圧モデルラットにおいて、血中ADMA濃度は、Angiotensin IIで有意に上昇し、DOCA saltでは上昇傾向を認めたものの有意ではなかった。

WKYとSHRにおける血中ADMA濃度は、血圧上昇前の4Wと上昇後の15Wのいずれにおいても、両者に全く差を認めなかった。また、WKYとSHRともに、4Wに比して15Wで血中ADMA濃度の有意の低下を認めた。

DDAHの血管壁での発現の検討では、5Wと14Wの両方で、SHRではWKYに比してDDAH I mRNAの発現が亢進していたが、DDAH II mRNA発現はWKYとSHRに差を認めなかった。一方、蛋白レベルでの検討では、WKYとSHRの4Wおよび12Wの両方で、両者に差は認められず、mRNAレベルの結果と異なる結果が得られた。

<考察>

体液貯留性高血圧において、血中ADMA濃度が上昇する機序は不明であるが、ADMA血中濃度の上昇の機序として、産生の増加、分解の減少、排泄の低下などが考えられる。また、血管組織においてADMAを加水分解する酵素DDAHは、mRNAレベル、蛋白レベルなどの各段階にわたって、その機能と発現が調節されている可能性がある。

　本研究は、心血管疾患における、Nitric Oxide (NO)の重要性が認識されるに伴い、NOSの活性を調節すると考えられているADMAおよびDDAHの生理的ないし病態における役割を明らかにするために行われたものであり、下記の結果を得ている。

1.動脈硬化の早期病変として、血管内皮細胞の機能異常があり、障害をもつ血管内皮細胞はNOの産生および放出が減少し、内皮依存性血管拡張反応が低下するといわれている。一方、ADMAは、血管病変進展と深く関わる加齢、高血圧、糖尿病などの動脈硬化危険因子を有する患者では、血中濃度が上昇することなどが、報告されており、ADMAが、Risk Factorによる血管内皮機能低下の一因になっている可能性がある。動脈硬化を促進すると言われている睡眠時無呼吸症候群sleep apnea syndrome (SAS)が注目されており、これまで内皮依存性血管拡張反応の低下が報告されているが、血中ADMA濃度の検討はなされていない。そこで、病態を改善するとされている持続陽圧呼吸療法nasal Continuous Positive Airway Pressure (nCPAP)療法の影響を検討した。その結果、睡眠時無呼吸症候群において、nCPAP治療により、病態(無呼吸、低酸素)を改善するだけでなく、血管内皮機能(%FMD)も改善を認め、さらに、睡眠時無呼吸症候群において、血中ADMA濃度と血管内皮機能が負の相関を示すことより、nCPAP後の血管内皮機能の改善において、血中ADMA濃度の低下の関与が示唆される。

2.動脈硬化の危険因子により内皮機能異常が存在する状況では、脱分化し合成型となった血管平滑筋細胞が新生内膜において増殖すると考えられ、NOは、新生内膜肥形成を抑制すると報告されている。前項での検討において、ある状況下における血管内皮機能異常と血中ADMA濃度に相関が認められることが示されたが、新生内膜形成におけるADMAの役割に関する報告は少ない。また、このADMAを加水分解する酵素DDAHの新生内膜における役割は全く知られていない。そこで、本研究では、血管平滑筋細胞の脱分化とDDAHの発現の相関を検討した。その結果、DDAH I, IIは、血管平滑筋細胞において脱分化の程度となんらかの関連性がある可能性があり、新生内膜形成に対して、抑制的に働く可能性があると考えられる。

3.血管病変進展と深く関わる加齢、高血圧、糖尿病などの動脈硬化危険因子を有する患者では、ADMAの血中濃度が上昇していることが報告され、高血圧の発症に血管内皮機能の障害が関与し、ある種の降圧治療により、血管内皮機能が改善すると言われている。この機序として、NOS活性が関与していると考えられているため、NOS活性を調節するADMAの関与に関して検討を行った。その結果、Angiotensin IIの高血圧モデルラットにおいて、血中ADMA濃度の上昇が認められ、一方、DOCA食塩高血圧モデルラットにおいては、血中ADMA濃度の変動が認められない。さらに、SHRとWKYにおいて血中ADMA濃度に差が認められないことが示された。

本論文は、NOSの活性を調節すると考えられているADMAおよびDDAHの、動脈硬化、高血圧における生理的ないし病態における役割を明らかにした。本研究は、ADMA/DDAH系と動脈硬化の関連の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位授与に値するものと考えられる。