【背景】

　中枢・末梢神経系の発生過程において、その特徴的な構造を作るためには、細胞とその周辺の細胞外基質(ECM)との相互作用が重要であることが知られている。神経発生と神経系の発達において、細胞外基質と細胞表面に局在してそれを分解する分子は重要な役割をになっている。例えば神経芽細胞・神経膠細胞の分化・細胞の移動・成長や軸索のガイダンスなどである。さらに分化過程において、ECMと細胞膜表面の分子の相互作用は選択的なシナプス形成の過程に関与すると考えられている。神経の発生において基底膜成分のECMが特に関与すると考えられるが、それぞれの分子の正確な役割は明らかではない。これまでにラミニンが神経細胞の移動と軸索伸長を促進することと、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどのプロテオグリカンは軸索伸長に抑制的に働くことが明らかにされている。

　MMP(マトリックスメタロプロテアーゼ)は活性中心にZn2+を保持するエンドペプチダーゼであり、ほとんどのECM成分の分解を担っている。これまでに哺乳類では21種類がクローニングされ、そのドメイン構造より可溶型MMPと膜型MMPに分類される。膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT-MMP)はそのファミリーとしてMT1-MMP〜MT6-MMPまでが報告されている。可溶型MMPがECM分解を組織の広い範囲で行うのに対し、MT-MMPは膜に局在していることから、細胞の増殖や移動、浸潤時に際して近接部位でのECMの分解において働いている。例えばもっとも研究の進んでいるMT1-MMPでは悪性腫瘍の浸潤時、血管新生中の内皮細胞、胎児発生段階の間質細胞、骨組織、創傷治癒の過程で発現しており、周辺の基質分解に関与していることが知られている。

　MT5-MMPはMT-MMPsの中でも脳に限局的に発現している点で特異的である。またMT5-MMPがコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとヘパラン硫酸プロテオグリカンを分解するが、ラミニンは分解しないという点は注目に価する。最近の研究でMT5-MMPがラットの神経系に主に発現することが示された。このことからMT5-MMPは神経系の働きと機能維持に特異的な役割を担っていることが示唆されたが、その詳細な解析はされていない。

　今回、マウス発生段階におけるMT5-MMPの発現を免疫組織染色とin situhybridizationにより調べた。MT5-MMPが胎児・成体ともに神経細胞特異的に発現していることを見出した。さらにin vitroでの分化誘導系と後根神経節の初代分散培養を用いることによって神経細胞の軸索伸長にどのように関与するかについて研究を行った。

　【結果】MT5-MMPが成体マウスにおいて発現している器官を明らかにするために、様々な組織のノザンブロットを行った。この結果、脳に特異的に発現していること、腎臓に弱い発現があることがわかった。さらに脳の発生段階においてどの時点からこの発現が開始するのか調べるために、胎生14.5日目〜16.5日までの全脳と、胎生17.5日〜生後30日目までの大脳・小脳それぞれのRNAを抽出し、同様にノザンブロットを行った。この結果、大脳皮質形成期である胎生14.5〜生後まで、MT5-MMPRNAの発現は増加し、それ以降減少した。これと対照的に、小脳でのMT5の発現は生後〜2週間までの小脳の形成時期に増加し、成体になってもその発現レベルは強いままであった。一方、大脳におけるMT5-MMPの発現量は生後では減少した。

　ノザンブロットでMT5-MMPが脳に発現していることが明らかになったので、脳のどの部位で発現しているかを確認するためにin situ hybridization、免疫組織染色を行った。胎生15.5日のマウス胎児で免疫組織染色を行ったところ、神経組織である脳・後根神経節・脊髄に発現を認めた。生後14日目の仔の全脳で同様に免疫組織染色を行ったところ嗅球からrostral tractにかけてと、海馬の歯状回、小脳のプルキンエ細胞と顆粒細胞に強い発現があった。生後60日の全脳で同様に免疫組織染色とin situ hybridizationを行ったところ、生後14日と同様に小脳と海馬、嗅球に強い発現があった。免疫組織染色とin situ hybridizationでは同様の結果が得られた。また、小脳におけるMT5-MMPの発現は、Neurofilamentと局在が同じであったが、ダリア細胞マーカーであるGFAPとは局在パターンを異にしていた。さらに成体の後根神経節でもMT5-MMPの発現が確認された。

　MT5-MMPの免疫組織染色により小脳に強い発現があることから、小脳の発生段階におけるMT5-MMPの役割を明らかにするために、DQTM-gelatinを用いたin situ zymographyによる酵素活性の確認を行った。DQTM-gelatinはクエンチング基質であり、プロテアーゼによりゼラチンが分解されると蛍光を発することによりゼラチン分解活性を観察出来る。生後1日目、9日目、90日目のマウスより小脳を単離し、凍結切片を作成、in situ zymographyを行ったところ、小脳のmigratingextemalce111ayerにゼラチン分解活性を認めた。隣接切片のHE染色と比較したところ、生後90日のマウス小脳ではプルキンエ細胞と顆粒細胞に強い分解活性があった。このゼラチン分解活性はMMP阻害剤であるBB-94で抑制され、セリンプロテアーゼ阻害剤(pefabloc)では抑制されなかった。これらの細胞はMT5-MMPを発現していることから本酵素のゼラチン分解への関与が推定された。

　In vitroにおける神経細胞分化誘導系としてよく用いられているembryonic carcinoma P19細胞が神経細胞に誘導をした時にMT1-MMP〜MT5-MMPの発現がどのように変化するかを見た。P19はレチノイン酸処理によりダリア細胞と神経細胞様に分化する。MT5-MMPが神経細胞のみに発現しているかどうかを見るために、分化誘導したP19をさらにDNA合成阻害剤であるAra-Cで処理してダリア細胞を除き、神経細胞を多く含む分画を得た。それぞれからRNAを抽出し、半定量的RT-PCRによりMT-MMPsとNeurofilament、GFAPの発現量の増減を見た。この結果、MT5-MMPはRA処理により増加し、Ara-C処理によってもその発現量は変化しなかった。一方、MT5-MMPと同様に脳に発現が見られるMT1-MMPは踏処理により発現が増加したが、Ara-C処理により発現が減少した。MT3-MMPは発現レベルは低いがMT5-MMPと同様にAra-C処理による発現の減少は見られなかった。MT2-MMP、MT4-MMPはRA処理、Ara-C処理によって影響は受けなかった。

　In vitroにおける分化誘導系でMT5-MMPは神経細胞に特異的に発現が上昇していることが示されたので、軸索伸長におけるMT5-MMPの役割を調べるために、マウス後根神経節のラミニン上での初代分散培養を行った。初代培養細胞においても、MT5-MMPの発現はNeurofilamentを発現している細胞に観察され、特に細胞体と軸索、さらに成長円錐の先端に局在していることが確認された。これまでにHSPGやCSPGなどのプロテオグリカンは軸索伸長に阻害的に働くとされているが、これらのプロテオグリカンをMT5-MMPのリコンビナント蛋白で処理するとラミニンを基質とした時と同じ程度まで軸索伸長は回復した。また、この効果はMMP阻害剤であるBB-94の添加により抑制された。このことからMT5-MMPは軸索の伸長に阻害的に働くプロテオグリカンを分解することで軸索の伸長を促進する可能性が示唆された。

【結論】本研究により神経特異的に発現するMT5-MMPが、どのような発生段階で脳組織のどの細胞に発現しているかがタンパク質レベル、mRNAレベルで明らかになった。成体でMT5-MMPの強い発現が見られた部位は神経の可塑性があるとされる領域であり、MT5-MMPが可塑性の形成に何らかの関与をしている可能性も考えられる。また、小脳の発生においては移動中の顆粒細胞層にMT5-MMPが局在し、その同じ細胞層にゼラチン分解活性が確認されたことから、MT5-MMPが何らかの細胞外基質を切断して顆粒細胞の移動を容易にしている可能性も考えられる。これまでにMT5-MMPは免疫組織染色によりラットの脳で発現していることと、その発生段階で大脳皮質と小脳のプルキンエ細胞と顆粒細胞層に発現していることが報告されていたが、その発現細胞が神経細胞に特異的であるのか、ダリア細胞によるものであるか明らかではなかった。今回、P19を用いたin vitro分化誘導系でneurofilament、MT5-MMP、GFAPmRNAの発現量を解析したところ、MT5-MMPの発現は神経細胞に特異的なものであることが示された。マウス後根神経節の分散初代培養においてneurofilamentとMT5-MMPの免疫染色を行ったことによりMT5-MMPはneurofilamentを発現している神経細胞に発現し、その発現は細胞体、軸索と成長円錐の先端に見られることが明らかになった。MT5-MMPの基質としては現在までにpro-MMP2、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどが報告されているが、軸索伸長阻害効果をもつとされているプロテオグリカンの基質上で培養を行ったところ、その阻害効果はMT5-MMPの添加により消失し、MT5-MMPがプロテオグリカンを切断することにより軸索伸長を促進する可能性が示唆された。MMP-2はニワトリの後根神経節分散初代培養でMT5-MMPと同様に軸索と成長円錐の先端に発現することが報告されており、MT5-MMPがMMP-2の活性化を行い、協同的に軸索伸長の際に働いている可能性もある。本研究は、これまでその発現部位と神経細胞における生理的役割が明らかでなかったMT5-MMPが神経細胞特異的に発現し、神経の軸索伸長を制御し、さらには神経のネットワーク形成に関与している可能性を明らかにした。

　本研究において、早下君は新規遺伝子MT5-MMPの発現をマウス組織と初代培養系を用いて詳細に解析し、以下の結果を得た。

1.新規遺伝子であるMT5-MMPのヒト・マウスでの組織における発現をNorthern blotにより明らかにした。さらにマウス組織でのMT5-MMPmRNAおよびproteinの発現を発生段階を追って明らかにした。

2.1よりMT5-MMPの発現は神経系に特異的であったことから、マウス胚性腫瘍細胞(P19)の分化誘導系を用いて、P19を神経細胞に分化誘導した際に、MT5-MMPの発現がNeurofilamentを発現している神経細胞に見られることを明らかにした。

3.マウス後根神経節の初代培養において、MT5-MMPはNeurofilamentを発現している神経細胞に共局在し、その局在は成長円錐の先端と軸索・細胞体に見られることを示した。

4.3で見られたMT5-MMPの発現が、軸索伸長阻害作用を示すとされているヘパラン硫酸プロテオグリカン・コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解することで軸索伸長を促進する可能性を示した。また、この軸索伸長促進効果は、MMP阻害剤の添加により消失した。

　以上の結果は、神経組織構築の際にMT5-MMPが関与していることを強く指摘している。即ち、本研究により神経特異的に発現するMT5-MMPが、どのような発生段階で脳組織のどの細胞に発現しているかがタンパク質レベル、mRNAレベルで明らかになった。成体でMT5-MMPの強い発現が見られた部位は神経の可塑性があるとされる領域であり、MT5-MMPが可塑性の形成に何らかの関与をしている可能性も考えられる。また、小脳の発生においては移動中の顆粒細胞層にMT5-MMPが局在し、その同じ細胞層にゼラチン分解活性が確認されたことから、MT5-MMPが何らかの細胞外基質を切断して顆粒細胞の移動を容易にしている可能性も考えられる。これまでにMT5-MMPは免疫組織染色によりラットの脳で発現していることと、その発生段階で大脳皮質と小脳のプルキンエ細胞と顆粒細胞層に発現していることが報告されていたが、その発現細胞が神経細胞に特異的であるのか、ダリア細胞によるものであるか明らかではなかった。今回、P19を用いたin vitro分化誘導系でneurofilament、MT5-MMP、GFAPmRNAの発現量を解析したところ、MT5-MMPの発現は神経細胞に特異的なものであることが示された。マウス後根神経節の分散初代培養においてneurofilamentとMT5-MMPの免疫染色を行ったことによりMT5-MMPは、neurofilamentを発現している神経細胞に発現し、その発現は細胞体、軸索と成長円錐の先端に見られることが明らかになった。MT5-MMPの基質としては現在までにpro-MMP2、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどが報告されていた。本研究で、軸索伸長阻害効果をもつとされているプロテオグリカンの基質上で後根神経節神経細胞の分散培養を行ったところ、その阻害効果はMT5-MMPの添加により消失し、MT5-MMPがプロテオグリカンを切断することにより軸索伸長を促進する可能性が示唆された。MMP-2はニワトリの後根神経節分散初代培養でMT5-MMPと同様に軸索と成長円錐の先端に発現することが報告されており、MT5-MMPがMMP-2の活性化を行い、協同的に軸索伸長の際に働いている可能性も考えられる。

　本研究は、これまでその発現部位と神経細胞における生理的役割が明らかでなかったMT5-MMPが神経細胞特異的に発現し、神経の軸索伸長を制御すること、さらには神経のネットワーク形成においてMT5-MMPが果たす新たな役割を提唱するものであり、今後の研究に大きく貢献するものと考えられ、学位の授与に値するものと考えられた。