細胞増殖抑制活性を持つTob(transducer of ErbB-2)は、受容体型チロシンキナーゼErbB-2からのシグナル伝達に関わる蛋白質として見い出さた。TobはB細胞リンパ腫の染色体転座位近傍より同定されたBTG1、及びp53依存的に発現が誘導されるPC3、これらの蛋白質と高い相同性を有する蛋白質として同定されたTob2、ANA、PC3Bと共にファミリーを形成する。これらTobファミリー蛋白質は、NIH3T3細胞に過剰発現させると細胞増殖抑制活性を持つ。また、Tobファミリー蛋白質はCaf1、Hoxb9、Id-1等の転写因子及び転写調節因子に結合し、様々な遺伝子の転写制御に関わっていることが報告されている。更に、当研究部において作製したtob遺伝子欠損(KO)マウスは大理石骨病棟の骨量増加を示した。Tob KOマウスを用いた解析により、TobはBMP-2下流のSmadsを介した転写活性を抑制し、骨芽細胞における負の制御因子として働くことが明らかとなった。一方でtob KOマウスは加齢に伴い様々な器官に高頻度に腫瘍形成し、tobがマウスにおける癌抑制遺伝子であることがわかった。しかし、Tobファミリー蛋白質の生理的機能、細胞増殖抑制や癌化における作用機構には依然として不明な点が多い。

　本研究ではTob並びにTobファミリー蛋白質の機能解明を目的として、(1)Tobの免疫担当細胞における機能解析、(2)Tobファミリー蛋白質の中で、Tobと最も相同性の高いTob2欠損マウス作成と解析、並びにTobとTob2の機能的相補性についてtob/tob2 KOマウスを用いた解析を行った。

　初めに、tob KOマウスに胸腺及びリンパ節に高頻度に悪性腫瘍ができることから、T細胞の増殖調節や癌化機構へのTobの関与に注目し、機能解析を行った。TobのT細胞における発現解析から、マウス脾臓由来T細胞及びAE7ヘルパーT細胞クローンにおいてTCR刺激依存的に一過的に発現が上昇することを見い出した。このことより、TobがT細胞においてTCR刺激依存的な働きを持つことが示唆された。

　そこで、tob KOマウスの由来T細胞を用いて解析を行った。しかしtob KOマウスのT細胞の分化に異常は認められなかった。一方、tob KOマウス脾臓由来T細胞にTCR刺激した際には、図1に示したように野生型マウス由来T細胞と比較し、細胞増殖、IL-2産生及びIFN-γ産生が亢進していた。

　Tobファミリー蛋白質は様々な遺伝子の転写制御への関与が報告されている。そこでTobがIL-2及びIFNγ遺伝子の転写を制御している可能性を考え、IL-2及びIFNγ遺伝子プロモーターのレポーターを用いたレポーターアッセイを行った。Jurkat T細胞株及びEL-4T細胞株にレポーターと共にTob発現ベクターをトランスフェクションし、TCR刺激もしくはPMA及びionomycin刺激をすると、Tobは濃度依存的にIL-2及びIFN-γ遺伝子プロモーターのレポーター活性を抑制していることがわかった。更にTobによるIL-2遺伝子プロモーター活性制御について詳細な検討を行う為、様々な変異型IL-2遺伝子プロモーターのレポーターを用い解析を行った。その結果、TobがIL-2遺伝子プロモーター上の、NFAT/AP1結合領域を介してIL-2遺伝子プロモーター活性を抑制することが示唆された。

　近年、当研究部における解析によりTobのリン酸化機構が明らかになった。Tobは、EGFやPDGFを初めとする細胞増殖因子によって活性化されたErk1/2によりリン酸化され、その結果細胞増殖抑制活性が減弱する。更に、NIH3T3細胞の活性化Ras及び活性化MEKによる足場非依存的な細胞増殖において、野生型及びTobのリン酸化型を模倣した変異体は抑制活性を持たないものの、Tobの非リン酸化型変異体は抑制する。これらの知見は、Tobのリン酸化制御が細胞増殖制御および癌化機構において非常に重要であることを示唆している。

　TobのErk1/2によるリン酸化部位は、Tobファミリー蛋白質の中でTob2においてのみ保存されている。その為、Tob2も細胞増殖因子からの刺激依存的にErk1/2にリン酸化される可能性が考えられた。そこで、血清もしくはPDGF刺激後のNIH3T3細胞の可溶化液を用い、Tob2のリン酸化についてウエスタンブロットにより解析したところ、刺激依存的にTob2のリン酸化による泳動度の変化が確認された。またこの泳動度の変化は細胞のMEKインヒビター(PD98059)処理により減弱することから、Tob2もTobと同様にErk1/2にリン酸化されることが示唆された。

　またTobはcyclin D1の発現を転写レベルで制御している可能性が、cyclin D1遺伝子プロモーターのレポーターを用いた解析から示唆されている。Tob2がTobと同様にcyclin D1遺伝子の転写の抑制活性を持つか、cyclin D1遺伝子プロモーターのレポーターを用いて解析した。その結果、図2に示す通りTob2は、Tobと比較し転写抑制活性は弱いものの、発現量依存的にcyclin D1遺伝子プロモーターの転写活性を抑制することがわかった。

　これらの結果から、Tob2は細胞内においてTobと同様に増殖因子からシグナルによるリン酸による制御をうけ、Tobと機能的に相補している可能性が考えられた。そこで、Tob2の生体内での機能及びTobとTob2の機能的相補性を解析するため、tob2 KOマウス及びtob/tob2 KOマウスを作製した。Tob2 KOマウス及びtob/tob2 KOマウスは、生後1年齢まで兇かけ上正常に発育し、繁殖も可能であった。

　Tob KOマウスが骨石灰化を制御する骨芽細胞の分化・増殖亢進により大理石骨病様の骨量増加を示すことから、tob2遺伝子欠損による骨代謝への影響を調べる為、tob/tob2 KOマウスの骨量解析を行った。その結果.驚くべきことにtob/tob2 KOマウスでは、tob KOマウスとは反対に骨量が減少していた(図3)。

　また、tob2 KOマウスの骨髄を用いた分化誘導実験で、骨吸収を制御する破骨細胞への分化の亢進が示された。このことにより、Tob2は破骨細胞の増殖・分化蜘制播性を持ち、その為tob/tob2 KOマウスの骨量減少が生じることが示唆された。骨芽細胞と破骨細胞におけるTob及びTob2の発現は、Tobは前者で高く後者で低い、Tob2は前者で低く後者で高いという、相反する発現パターンを示すことがわかっている。骨形成に関わるこの2種の細胞においてこのような発現パターンを示すことにより、TobもしくはTob2の欠損をもう一方の蛋白質が機能的に補うことが出来ず、骨量の増加及び減少という相反する表現型が表れたことが示唆される。

　以上の解析によりTob及びTob2は成体内の様舞な組織において、細胞の増殖・分化を抑制する働きを持つことが示された。また、TobとTob2は様々な組織において機能的に相補していることが示唆された。

　今後、Tob及びTob2の個体内の免疫系における機能、細胞の分化増殖制御、及び癌化機構における機能の解明の為には、tob、tob2、及びtob/tob2 KOマウスを用いた更なる解析が必要である。また、Tob及びTob2の個体レベルにおける機能的相補性を、Tob及びTob2の発現部位に着目し解析していくことが重要であると考えられる。

図1:tob遺伝子欠損マウス脾臓由来T細胞の増殖及びサイトカイン産生の亢進

(A)脾臓細胞を表示した濃度の抗CD3抗体(2C11)と抗CD28抗体(PV-1)、1μg/ml抗CD3抗体と10ng/ml IL-2、5ng/ml PMAと05μM ionomycinで刺激後、3H-チミジンの取り込みを指標に増殖を解析した。

(B、C)脾臓細胞を表示した様に刺激し、2日後の培養上清に含まれるIL-2の濃度をELISA法を用い解析した。

(D、E)脾臓細胞を表示した様に刺激し、2日後の培養上清に含まれるIFN-γの濃度をELISA法を用い解析した。

図2:Tob2のcyclin D1遺伝子プロモーター抑制活性

説明は本文参照。

図3:tob/tob2遺伝子ダブル欠損マウスの骨量解析

(A)野生型マウス、(B)tob KOマウス、及び(C)tob/tob2 KOマウスの大腿骨のμCT像

　本論文は2章からなり、第1章では細胞増殖抑制能を持つTob蛋白質がT細胞において果たす役割の解明について、第2章ではTobファミリー蛋白質であるTob2の遺伝子欠損マウス及びtob/tob2遺伝子ダブル欠損マウスの作製及びその解析について述べられている。本論文の内容は以下のように要約される。

　第1章において、論文提出者はtob KOマウスに胸腺及びリンパ節に高頻度に悪性腫瘍ができることに注目し、T細胞の増殖調節や癌化機構へのTobの関与を解析した。TobのT細胞における発現解析から、TobはT細胞抗原受容体(TCR)刺激依存的に一過的に発現が上昇することを見い出した。

　そこで、TobのT細胞におけるTCR刺激依存的な働きに着目し、tob KOマウス由来T細胞でのTCR下流シグナル伝達や遺伝子発現を解析した。Tob KOマウス脾臓由来T細胞にTCR刺激した際に、野生型マウス由来T細胞と比較し、細胞増殖、IL-2産生及びIFN-γ産生が亢進していた。

　Tobファミリー蛋白質は転写因子と会合し様々な遺伝子の転写制御に関与することが報告されている。そこでTobがIL-2及びIFNγ遺伝子の転写を制御している可能性を考え、IL-2及びIFN-γ遺伝子プロモーターのレポーターを用いて、これらの遺伝子の発現調節へのTobの関与を調べた。その結果、TobはTCR刺激もしくはPMA及びionomycin刺激によるIL-2及びIFN-γ遺伝子プロモーター活性を抑制していることが示唆された。更に変異体を用いたTobによるIL-2遺伝子プロモーター活性制御の詳細な検討の結果、TobがIL-2遺伝子プロモーター上の、NFAT/AP1結合領域を介してIL-2遺伝子プロモーター活性を抑制することを示した。

　第2章において、論文提出者ははじめにTob2のリン酸化機構について解析を行った。すでにTobのリン酸化機構はEGFやPDGFを初めとする細胞増殖因子によって活性化されたErk1/2によりリン酸化されることが報告されていた。そこでTob2のErk1/2によるリン酸化を解析したところ、Tob2もTobと同様に細胞増殖因子刺激依存的にErk1/2によってリン酸化されることを示した。更に、cyclin D1遺伝子プロモーターのレポーターを用いた解析から、Tob2はTobと同様にcyclin D1の発現を転写レベルで制御していることを示唆する結果を得た。この結果は、Tob2も又細胞内においてTobと同様に増殖因子からシグナルによるリン酸による制御をうけ、Tobと機能的に相補している可能性が考えられた。そこで、Tob2の生体内での機能及びTobとTob2の機能的相補性を解析するため、tob2 KOマウス及びtob/tob2 KOマウスを作製した。その結果tob2 KOマウス及びtob/tob2 KOマウスは、生後1年齢発育・繁殖共に正常であることを示した。

　tob KOマウスが骨石灰化を制御する骨芽細胞の分化・増殖亢進により大理石骨病様の骨量増加を示すことから、tob2遺伝子産物の骨形成への関与を調べた。Tob2遺伝子欠損による骨代謝への影響を調べる為、tob/tob2 KOマウスの骨量解析を行った。その結果、tob/tob2 KOマウスでは、tob KOマウスとは反対に骨量が減少していた。更に、tob2 KOマウスの骨髄を用いた分化誘導実験により、骨吸収を制御する破骨細胞への分化の亢進を示した。このことにより、Tob2は破骨細胞の増殖・分化抑制活性を持ち、その為tob/tob2 KOマウスの骨量が減少すると考えられた。

　以上、論文提出者はTob及びTob2が成体内の様々な組織において、細胞の増殖・分化を抑制する働きを持つことを示した。また、Tob及びTob2が、免疫、骨の代謝、腫瘍形成の抑制という生体内機能において重要な役割を果たしていることを示した。本論文は、免疫系において自己免疫疾患、成体移植の拒絶反応の抑制、骨形成において骨粗鬆症の治療、更に腫瘍形成の抑制等、ヒト疾患の治療法の開発につながる研究であると考えられる。したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。

　なお、本論文第2章の一部は池松　直子氏・吉田　富氏・大杉　美穂氏・山本　雅氏との共同研究であるが、論文提出者が主体となって分析及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。