Hydrogenobacter thermophilusTK-6株は生育至適温度70℃の絶対独立栄養性水素細菌あり、分子状水素あるいはチオ硫酸をエネルギー源として利用し、還元的TCAサイクルによって炭酸固定を行っている。そして、16SrDNA塩基配列による解析から、系統分類学的に最も初期に分岐した真正細菌であることが知られている。また、本菌と近縁にある真正細菌Aquifex pyrophilusは硝酸呼吸によって生育が可能であることが報告されている。TK-6株が利用可能な呼吸の最終電子受容体としてこれまでに分子状酸素だけが知られていたが、以上のことから本菌が硝酸呼吸能を有するのではないかということに着目した。

　本研究では、このような興味深い系統分類学的位置付けにあるTK-6株を対象とし、微生物における呼吸代謝の進化に関する知見を得ることを目的とした。まず本菌が硝酸呼吸を行うかどうかを明らかにし、さらにその特徴を生化学的に解明するために、異化型硝酸呼吸の鍵酵素である亜硝酸還元酵素(nitrite reductase;NIR)と一酸化窒素還元酵素(nitric oxide reductase;NOR)がどのような性質を持つのかについて解析を行った。

1．硝酸呼吸能の実証と生育特性

　本菌が分子状水素をエネルギー源とし、嫌気条件下で硝酸を最終電子受容体として利用するか否かを調べた結果、生育が認められたうえ、中間体である亜硝酸が培養液中に検出され、硝酸呼吸能を有していることが明らかとなった。続いて、Na15NO3を用いた培養により得られた気相のGG-MSによるガス分析を行い、どのような経路で硝酸呼吸を行うかを調べた。その結果、15NO、15N20、15N2が検出され、本菌がN2生成型硝酸呼吸(脱窒)を行うことが示された。

　次にジャーファーメンターを用いて、培養経過の解析を行った。菌の増殖とともにNIR活性をモニタリングした結果、培養液中の硝酸が消費されるにしたがいNIR活性が減少していくことが示された。また、Feの量を通常の無機培地の5倍含む培地を用いて培養を行った場合に、培養液中に亜硝酸がほとんど検出されないという特徴が見られた。微生物のNIRはcytochrome cd1型とCu型とに分類されることが知られているが、本菌がどちらのNIRを持つのかを調べるため、硝酸呼吸により生育した菌体の粗酵素液に対し、cytochrome cd1型NIRを持つPseudomonas aeruginosaおよびCu型NIRを持つAlcaligenes faecalis S6のNIR抗体を用いてWestern blottingを行った。その結果、前者とだけに結合が観察され、発色強度もNIR活性に対応していた。さらに、同粗酵素液を用いヘム染色を行い、Western blottingと同様の発色を呈することを確認した。以上の結果により、本菌のNIRはcytochrome cd1型であることが示された。

2．NIRの精製およびその遺伝子の解析

　本菌のNIRの特徴を明らかにするために、硝酸により培養した菌体からその完全精製を行った。cell-free extractを調製し、硫安分画を行ったところ、50-70%飽和硫安画分において高い比活性が検出された。この画分を疎水性カラム(Phenyl SepharoseおよびResourcePHE)、陽イオン交換カラム(MonoS)に通すことによりSDS-PAGE上で単一のバンドとなり、精製酵素が得られた。これを用い、ゲル濾過カラムにより分子量の測定を行った。その結果、native enzymeの分子量は75kDaと決定された。これは、これまでに知られているホモダイマーのサブユニット構造を持つNIRの分子量と比較して非常に小さい数値であった。一方、SDS-PAGEにより決定したモノマーの分子量は61.5kDaであることを考えあわせると、本酵素がゲル濾過において実際よりも低分子域に溶出されるような構造を取っていることが考えられた。

　次に、NIR遺伝子(nirS)の解析を行うために、プローブ作製に必要なN末端アミノ酸配列の決定を試みたが、この部分が修飾されており配列は得られなかった。そこで、加水分解して内部配列の決定を行ったところ、Pseudomonas stutzeriのNIRとの間に相同性を持つペプチドの配列が得られた。この配列とnirS保存領域の配列を基としてプローブを作製した。このプローブを用いてPCR断片を取得し、さらにprimer walkingによりnirSと周辺領域の塩基配列を決定した。その結果、nirSのプロモーター領域には-10および-35配列が存在した。nirSは通常DNRタイプかσ54依存型のNorRタイプのNO応答転写調節因子によって制御されているが、本菌のnirSにはこれらのタイプに見られるプロモーター配列が存在しなかったことから、既知のものとは異なる調節機構が働いていると考えられた。また、ホモロジー解析により、nirS上流には未知の遺伝子が、下流にはnirNが存在することがわかった。

3．NOR遺伝子のクローニング

　norCB保存領域の配列を基にプローブを作製し、本菌のnorCBのクローニングを行った。コロニーハイブリダイゼーションにより、4.5kbのSacI断片と5.2kbのSacI-BamHI断片が取得され、この二つの断片によりnorCBとその近傍の塩基配列を決定した。norCの上流には未知の遺伝子が、norBの下流にはorf85、orf91、def、orf95、lysR2が存在したが、周辺にはNORの活性化に必要とされるnorQやnorD等の遺伝子が存在せず、他の脱窒菌とは異なる構造を持っていた。また、nirSと同様にnorCBのプロモーター領域にも-10および-35配列が存在しており、norCBにおいても本菌の調節機構がDNRタイプやNorRタイプとは異なるものであることが示唆された。さらに、決定された配列からNorCBのハイドロパシープロットを作成したところ、他の菌ではNorCは1回膜貫通型であるのに対し、本菌のものは2回膜貫通構造であることが示された。これに対し、NorBは12回膜貫通構造を持つことが示され、他の菌のNorBの構造と一致していた。NorCおよびNorBの配列から近隣結合法により系統樹を作成し、他菌種由来のものと比較したところ、どちらのサブユニットもMethylococcus capsulatusと最も近い位置にあることがわかった。

4．NIR・NORの発現

　H.thermophilusのchromosomal DNAをテンプレートとして、決定されたnirSおよびnorCBの配列を用いてPCRにより両遺伝子を増幅し、これらを広宿主域発現プラスミドpMMB67HE (nirS)あるいはpMMB67EH(norCB)に連結して発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドを用いて、脱窒菌であるP．aeruginosaを宿主として発現を試みた。菌株にはRM488(-nirS株)、RM495(-norCBD株)、PAO1(wild type)を用いた。50mMNaNO3、1mMIPTGを含む培地を用い、好気的に振盪培養を行ったところ、TK-6株のnirSを導入したRM488(RM488+HTnirS)は生育が観察されたが、PAO1と比較して菌の増殖が抑制されていた。一方、同条件での培養でnorCBを導入したRM495(RM495+HTnorCB)は生育がかなり悪くなっていた。これは、宿主のNIR、NORとの間に構造的な相違があるため、宿主の生育に阻害的な影響を及ぼしていることが考えられた。また、どちらの形質転換体でも脱窒による嫌気的生育は相補できなかった。続いて、粗酵素液に対しヘム染色を行ったところ、RM488+HTnirSはバンドが出たが、RM495+HTnorCBは出なかった。RM488+HTnirSについてはWesterm blottingも行い、バンドの出現を確認した。さらに、活性測定を行い、RM488+HTnirSの粗酵素液が活性を持つことが示された。以上の結果から、TK-6株のNIRはP.aeruginosaの細胞内で機能的に発現していることが示されたが、ヘム染色で確認した酵素量よりも活性が低いことから、heme d1の供給が律速になっていると考えられた。また、RM495+HTnorCBの粗酵素液にNO還元活性は認められなかったため、NORは機能的に発現していないと考えられた。

まとめ

　本研究ではH．thermophilusTK-6株が硝酸呼吸(脱窒)により嫌気的に生育し、cytochromecd1型のNIRとcytochrome bc型のNORを持つことを示し、両酵素の構造遺伝子nirS、norCBの解析を行った。プロモーター領域の解析から、本菌のnirSとnorCBの発現は、他の脱窒菌で報告されているDNRやNorRタイプのNO応答転写調節因子と異なる機構で発現制御されていることが示唆された。また、NorCが2回膜貫通のハイドロパシーを示すなど、他の脱窒菌由来の酵素とは異なる特徴を持っていた。さらに、P.aeruginosaのnirS,norCB欠損株を用いた相補実験では、活性型のNIRは発現するが、NORは機能的に発現しなかった。TK-6株由来のnirS8とnorCBはP.aeruginosaの欠損株の嫌気的生育を相補せず、むしろ好気条件での生育を阻害した。この結果からもTK-6株由来のNIRとNORの特異性が示された。今後、本菌の脱窒遺伝子の発現調節機構や脱窒酵素の特徴をさらに解析することで、硝酸呼吸の進化的起源に関する知見が得られることが期待される。

　Hydrogenobacter thermophilusTK-6株は16SrDNA塩基配列による解析から、系統分類学的に最も初期に分岐した真正細菌であることが知られている。本研究では、このような興味深い系統分類学的位置付けにあるTK-6株を対象とし、微生物における呼吸代謝の進化に関する知見を得ることを目的とした。本菌と近縁にある真正細菌Aquifex pyrophilusは硝酸呼吸によって生育が可能であることが報告されている。本菌の硝酸呼吸について、その特徴を生化学的に解明するために、まず生育特性を調べ、さらに異化型硝酸呼吸の鍵酵素である亜硝酸還元酵素(nithte reductase;NIR)と一酸化窒素還元酵素(nitric oxide reductase;NOR)がどのような性質を持つのかについて解析を行った。本論文は序論および4章からなる。

　第1章では、本菌が硝酸呼吸能を持つことが実証された。分子状水素をエネルギ-源とし、嫌気条件下で硝酸を最終電子受容体として培養を行った際に、菌の生育が認められ、亜硝酸が培養液中に検出された。続いて、Na15NO3を用いた培養における気相のガス分析により、15NO、15N20、15N2が検出され、本菌がN2生成型硝酸呼吸(脱窒)を行うことが示された。次に、硝酸呼吸により嫌気的に培養した菌体の粗酵素液に対し、Western blottinを行った。cytochrome cd1型NIRを持つPseudomonas aeruginosaおよびCu型NIRを持つAlcaligenes faecalis S6のNIR抗体を用いたところ、前者とに結合炉観察されたことか本菌のNIRはcytochrome cd1型であることが示された。また、同粗酵素液についてヘム染色での発色も確認された。

　第2章では、硝酸により培養した菌体からNIRの完全精製を行い、NIR遺伝子(nirS)の全塩基配列を決定した。cell-free extractを調製し、硫安分画、疎水性カラム(Phenyl SepharoseおよびResource PHE)、陽イオン交換カラム(MonoS)の順に分離を行い、精製酵素が得られた。次にNIR遺伝子(nirS)の解析を行った。精製NIRからN末アミノ酸配列は修飾のため得られなかったので、内部アミノ酸配列とnirS保存領域の配列を基としてプロ-ブを作製した。このプロ-ブを用いてPCR断片を取得し、さらにprimer walkingによりnirSと周辺領域の塩基配列を決定した。その結果、nirSのプロモーター領域には-10および-35配列が存在した。本菌のnirSにはこれまでに知られているDNRタイプかσ54依存型のタイプに見られるプロモーター配列が存在しなかったことから、既知のものとは異なる調節機構が働いていると考えられた。また、ホモロジ-解析により、nirS下流にはnirNが存在することがわかった。

　第3章では、norCB保存領域の配列を基にプロ-ブを作製し、本菌のnorCBのクロ一ニングを行った。コロニーハイブリダイゼ-ションにより、4.5kbSocI断片と5.2kb SacI-BamHI断片が取得され、この二つの断片によりnorCBとその近傍の塩基配列を決定した。その結果、周辺にはNORの活性化に必要とされるnorQやnorD等の遺伝子が存在せず、他の脱窒菌とは異なる構造を持つことが示された。また、nirSと同様にnorCBのプロモーター領域にも-10および-35配列が存在した。norCBにおいても本菌の調節機構がDNRタイプやNorRタイプとは異なるものであることが示唆された。ハイドロパシ-により本菌のNorCは2回膜貫通構造を持つことが示され、他の菌とは構造が異なることが明らかとなった。NorCおよびNorBの系統樹からは、どちらのサブユニットもMethylococcus capsulatusと最も近い位置にあることが示された。

　第4章では、脱窒菌であるP.aeruginosaを宿主として、NIRおよびNOR発現を試みた。宿主にはRM488(-nirS株)、RM495(-norCBD株)、PAO1(wild type)の菌株を用いた。NIRおよびNORの形質転換体は、どちらも脱窒による嫌気的生育は相補できず、むしろその発現により生育阻害が起こり、宿主のnative酵素との間に構造的に相違があることが示唆された。粗酵素液に対しヘム染色を行ったところ、RM488+HTnirSはバンドが出たが、RM495+HTnorCBは出なかった。RM488+HTnirSについてはWestern blottingも行い、バンドの出現を確認した。さらに、同粗酵素液がNIR活性を持つことが示された。このように、TK-6株由来のNIRはP.aeruginosaの細胞内で機能的に発現していることが示された。しかし、RM495+HTnorCBの粗酵素液にNO還元活性は認められなかったため、NORは機能的に発現していないと考えられた。

　以上、本論文はTK-6株のNIR・NORおよびその遺伝子について、他菌種との構造や性質の相違を示したものであり、学術上応用上寄与するところが少なくない。よって、審査員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。