序論

　Acidianus brierleyは、生育至適温度70℃及び生育至適pH1.5〜2を有する通性嫌気性、好熱性、通性独立栄養性の硫黄代謝生アーキアである。本菌は、独立栄養的生育時には修飾型3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルを炭酸固定サイクルとして機能させていることが既に報告されている。3一ヒドロキシプロピオン酸サイクルは当初は緑色非イオウ細菌であるChloroflexus auranticusで提案されたものであるが、最近ではアーキアでも機能性が示唆されている。本サイクルにおいて実際に炭酸固定を触媒している酵素はAcety-CoA carboxylaseとPropionyl-CoA carboxylaseである。Chloroflexus auranticusにおいては3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルの酵素の内、Malonyl-CoA reductaseとPropionyl-CoA synthaseが既に精製されているが、本サイクルの鍵酵素とも言える炭酸固定酵素は未だ精製されていない。

　Acety-CoA carboxylaseとPropionyl-CoA carboxylaseはそれぞれ脂肪酸合成と二次代謝物合成に関与していることが知られている。この2種の酵素は植物、動物、酵母、藻類、並びにバクテリアを起源として精製されている。しかしながら、アーキアからの精製例は報告されていなかった。以上のような背景の下、本研究ではA.brierleyiからのAcetyl-CoA carboxylaseとPropionyl-CoA carboxylaseの精製と生化学的性質を明らかにすることを目的とした。さらに、大腸菌の変異株を用いた相補性試験により遺伝子の機能的発現も試みた。以下に、本論文の概要を述べる。

1．Acidianus brierleyiの独立栄養的増殖

　まず、A.brierleyiを、通気ガス(10%CO2並びに90%空気流量:35Lmin-1)中の炭酸ガスを唯一炭素源・培地中のテトラチオン酸(S4O62-)を唯一エネルギー源として、完全無機培地を用いて独立栄養的に培養した。70℃かつpH2.0なる至適培養条件下で本菌は、回分培養においてμmax0.057±0.010h-1(倍化時間:18.0±3.1h)で、fed-batch培養においてμmax0.034±0.006h-1(倍化時間:29.7±5.8h)で生育した。回分培養における乾燥菌体の収量は0・066±0.014g/Lであり、fed-batch培養における値(0.067±0.011g/L)と概ね同等であった。一方、回分培養におけるモル増殖度は2.42±0.24g/molであり、fed-batch培養における値(3.60±0.91g/mol)の約2/3であった。全体として、46Lの培養液から約30.6gの湿菌体を調製できた。

2．Acidianus brierleyiからのAcyl-CoA carboxylaseの精製と特徴付け

　Streptavidin-peroxidase conjugateを用いたブロッティング実験から本菌中には1種類だけのAcyl-CoA carboxylaseが存在していることが示唆された。本酵素は、Streptavidinを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーとSuperose6を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製された。精製途上においては、Acetyl-CoA carboxylase活性の認められる全てのフラクションにおいて、Propionyl-CoA carboxylase活性が測定された。また、精製過程の全てにわたりAcetyl-CoA calboxylaseとPronionyl-CoA carboxylaseの比活性の比は一定であった。この結果は、A. brierleyiのAcyl-CoA calboxylaseが修飾型3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルにおいて二機能性酵素であることを示している。Acetyl-CoA carboxylaseを本指標として、無細胞抽出液中の存在量を概算した所、全蛋白質の約4%がAcyl-CoA carboxylaseであることが示された。本菌においては、独立栄養的生育時に、Acel-CoA carboxylaseが誘導されることが知られており、上記知見はこうした過去の知見と合致するものである。精製酵素の比活性はAcetyl-CoA carboxylaseベースでは145±1.01μmol fixedCO2min-1mg-1であり、Propiony1-CoA carboxylaseベースでは11.9±0.92μmolfixedCO2min-1mg-1であった。

　精製酵素の活性がアビジンにより阻害されたことから、精製Acyl-CoA carboxylaseがビオチン酵素であることが明らかとなった。本酵素は、見かけの分子量がそれぞれ62、59、20kDaである3サブユニットからなる、新規なサブユニット数を有することが示された。また、全体の分子量が540kDaであることが示され、サブユニット構造としてはα4β4γ4構造をとっていることが示唆された。アミノ末端アミノ酸配列解析からは、59kDaの蛋白質がBiotin Carboxylase (BC)であり、20kDaの蛋白質がBiotin carboxyl camier protein(BCCP)であることが示された。精製酵素の至適温度は60〜70℃、至適pHは6.4〜6.9であった。精製酵素はAcetyl-CoAあるいはPropionyl-CoA、ATP、Mg2+、並びにHCO3-を活性発現のために絶対的に必要としていた。Acetyl-CoAに対する見かけ上のKm値並びにVmax値は、それぞれ0.17±0.03mM、43.3±2.8U�r-1であり、Propionyl-CoAに対するそれぞれの値は0.10±0.008mM、408±1.OU�r-1であった。この結果は、A.brierleyiのAcyl-CoA carboxylaseが修飾型3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルにおいて二機能性酵素であることをさらに裏付けている。また、Acetyl-CoA carboxylase活性もPropiony1-CoA carboxylase活性もmalonyl-CoA,methymalonyl-CoA,succinyl-CoAあるいはCoenzymeAにより阻害されたが、palmitoyl-CoAによっては阻害されなかった。

3．A.brierleyiからのAcy1-CoA carboxylaseをコードする遺伝子のクローニングと配列解析

　Southem hybridizationのためのDNAプローブは、BCとBCCPのそれぞれのアミノ末端のアミノ酸配列をもとに合成したプライマーを用い、PCRにより調製した。上記プローブを用いて検出された2種類のXbaIフラグメント(3.5 kb XbaI並びに8.0kb xbaI)を選択し、3.5kbのフラグメントはpSXbを用い、8.0kbのフラグメントはpLXbを用いてクローニングを行った。3.5kbのフラグメントはEcoRIにより、また、8.OkbのフラグメントはPstIによりサブクローン化を行った。サブクローン化されたフラグメントの遺伝子配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて遺伝子の両方向から決定した。BCサブユニットはaccC(position2036-3565)によりコードされており、509アミノ酸残基から成っていた。また、BCCPサブユニットはaccB(position3565-4068)によりコードされており、167アミノ酸残基から成っていた。accBの開始コドンの初めのヌクレオチドはaccCのストップコドンの3番目のヌクレオチドと重なっていた。5番目のORF(pccB,position 4149-5723or 4176-5723)はカルボキシトランスフェラーゼ(CT)をコードしていたが、開始コドンとなる可能性のあるコドンが2箇所(4149或いは4176)見出された。初めのコドン(4149)は、直上流にリボゾーム結合部位(RBS)が見出されたが、二番目のコドンには見出されなかった。このことは、初めのATGが開始コドンであることを示唆しており、pccBは524アミノ酸残基をコードしていることが示唆された。本菌のAcyl-CoA carboxylase遺伝子のプロモーター配列、リボゾーム結合部位(RBS)、並びに転写終結シグナルはアーキアの既知の配列との比較によって同定された。結果としては、accCとaccBはオペロンとして、pccBは単独のmRNAとして転写されていることが示唆された。

　蛋白質のMultiple sequence alignment解析によって、アーキア由来のアミノ酸配列はユーカリアよりも寧ろバクテリアにより近いことが示された。なお、他の生物において知られているモチーフのいくつかは、本菌においても保存されていた。例えば、本菌のBCの配列においては、ATP結合に関わるグリシンに富んだ領域並びに4つの活性中心残基が認められた。さらに本菌のBCCPにおいては、EAMK35S配列としてのビオチン結合部位、並びに、周辺配列が高度に保存されていた。なお、EAMK35S配列におけるリジン残基はビオチン化される部位であるが、多くのビオチン酵素において同リジン残基はC末端から35番目のアミノ酸として存在しており、本菌においても同様であった。上述の周辺配列の保存性に関しては、グリシン並びにプロリン残基の、リジン残基からの相対的位置取りという点で、他の生物由来のものと同様であった。即ち、リジンの位置を0とすると、プロリン(-29)、グリシン(-16)、グリシン(-10)、グリシン(+11)力地種生物由来のものと同様に保存されていた。また、本菌のCTサブユニットにはacyl-CoA結合部位並びにカルボキシビオチン結合部位が認められた。

4．Acyl-CoA calboxylase遺伝子の大腸菌変異株における機能的発現

　A. brierleyiのAcy1-CoA carboxylase遺伝子をPCR法によりゲノムDNAから単離した。accBとpccBの中間領域を除去し、pccBの上流には大腸菌のRBSを導入した。得られたフラグメントの配列の正しさ確認した後、pUC19もしくはpeT21に連結し、それぞれpUACC7あるいはpEACC5を作成した。PUACC7で形質転換したE.coli JM109株を用いてACC遺伝子群を発現させた場合、極少量のBCCP蛋白質のみが可溶性画分もしくはインクルージョンボディー画分に生産されるだけであった。一方、pEACC5で形質転換したE.coliBL21(DE3)株を用いた場合には、著量のBCCPが可溶性画分に検出された。加えて、BCとCTもインクルージョンボディー画分に多量に生産されていた。しかしながら、発現されBCCPをStrepttavidin法により解析した所、E.coliのBCCPに比べるとA.brierleyi BCCPへは、極微量のビオチン分子しか取り込まれていないことが明らかとなった

　A. brierleyiのBCCPがE.coliのBCCPを相補できるか否かを決定するためE.coliL8[accB22(Ts)]を用いた実験を行った。上記E.coliの温度感受1生変異株は30℃では生育できるが、それ以上の温度ではBCCP蛋白質を作れないため生育できなくなる。pUACC7で形質転換されたE.coliL8株は42℃では生育できず、A.brierleyi のBCCPはE.coliのBCCPを相補できなかった。次に、recombinant酵素を活性型として得るために、E.coliBL21(DE3)株を用いて、accC-accBとpccBを別々に発現させることを試みた。この場合、BCとCTはインクルージョンボディーとして生産され、6 M guanidine-HClにより可溶化された。しかしながら、希釈並びに透析によるrenaturationの過程で蛋白質のaggregationが生じたため、可溶化蛋白質を再構成することは出来なかった。

5．結論

　A.brierleyiからのAcyl-CoA carboxylaseの精製と特徴付けをまず行った。これは、アーキアとしては初めての例である。精製酵素は以下の点において他のacetyl-CoA carboxylaseと共通の性質を示した。即ち、(1)ビオチン並びにATPに依存するカルボキシラーゼである。(2)反応に、二価金属(Mg2+)、重炭酸、ならびにacctyl-CoA(或いはpropionyl-CoA)を必要とする。(3)3つの機能部位を有し、保存モチーフを有する。しかしながら、A.brierleyiのAcy1-CoA carboxylaseのいくつかの性質はAcetyl-CoA carboxylaseとは異なっていた。そうした性質とは、サブユニット構造、Acetyl-CoAとPropiony1-CoAに対するKmの比、至適pH及び至適温度、さらにはpalmitory-CoAによる酵素の活性化である。こうした結果から、精製Acy1-CoA carboxylase がその機能面と特質面で特異なものであることを示す一方、アミノ酸配列の保存から示されるように分子レベルでは他の酵素と共通の性質を示すことを、明らかにした。

　なお、BCとBCCPの3次元構造は既に明らかにされているが、CT並びホロ酵素の結晶構造は未だに報告されていない。そのため、A. brierleyiのAcy1-CoA carboxylaseの結晶構造解析が将来の研究として大いに期待される所である。

　独立栄養生物における炭酸固定経路として、現在までに4種類のものが知られている。この内、3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルは当初は緑色非イオウ細菌であるChloroflexus auranticusで提案されたものであるが、最近ではアーキアでも機能性が示唆されている。なお、Chloroflexus auranticusにおいては3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルの酵素の内、Malonyl-CoA reductaseとPropionyl-CoA synthaseが既に精製されているが、本サイクルの鍵酵素とも言える炭酸固定酵素(Acetyl-CoA carboxylaseとPropionyl-CoA carboxylase)は未だ精製されていない。そこで申請者は、炭酸固定経路として3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルを機能させているAcidianus brierley (生育至適温度70℃及び生育至適pH1.5〜2を有する通性嫌気性、好熱性、通性独立栄養性の硫黄代謝性アーキア)のAcetyl-CoA carboxylaseとPropionyl-CoA carboxylaseの精製と生化学的性質を明らかにすることを目的として研究を行った。

　以下に、本論文の概要を述べる。

　第1章の緒言においてはこれまでの知見と本研究の意義付けについて詳細に述べている。第2章においては、Acidianus brierleyiの独立栄養的増殖に関して詳細な検討を加えた結果を述べている。まず、A. brierleyiを、通気ガス(10%CO2並びに90%空気　流量:35Lmin-1)中の炭酸ガスを唯一炭素源、培地中のテトラチオン酸(S4O62-)を唯一エネルギー源として、完全無機培地を用いて独立栄養的に培養した。70℃かつpH2.0なる至適培養条件下で本菌は、回分培養においてμmax0.057±0.010h-1(倍化時間:18.0±3.1h)で、fed-batch培養においてμmax0.034±0.006h-1(倍化時間:29.7±5.8h)で生育した。全体として、46Lの培養液から約30.6gの湿菌体を調製できた。

　第3章においては、Acidianus brierleyiからのAcyl-CoA carboxylaseの精製と特徴付けについて述べている。Streptavidin-peroxidase conjugateを用いたブロッティング実験から本菌中には1種類だけのAcyl-CoA carboxylaseが存在していることが示唆された。本酵素は、Streptavidinを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーとSuperose6を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製された。精製酵素の比活性はAcetyl-CoA carboxylaseベースでは145±1.Ol μmol fixed CO2 min-1 mg-1であり、Propionyl-CoA carboxylaseベースではl19±0.092μmol fixed CO2min-1mg-1であり、酵素の二機能性が示された。また、精製酵素の活性がアビジンにより阻害されたことから、精製Acyl-CoAcarboxylaseがビオチン酵素であることが明らかとなった。さらに本酵素は、見かけの分子量がそれぞれ62、59、20kDaである3サブユニットからなる、新規なサブユニット数を有することが示された。また、全体の分子量が540kDaであることが示され、サブユニット構造としてはα、β、γ、構造をとっていることが示唆された。アミノ末端アミノ酸配列解析からは、59kDaの蛋白質がBiotin Carboxylase(BC)であり、20kDaの蛋白質がBiotin carboxyl carrier protein(BCCP)であることが示された。精製酵素の至適温度・至適pH・各基質に対する見かけ上のkm値並びにVmax値も求めている。なお、Acetyl-CoA carboxylase活性もPropionyl-CoA carboxylase活性も、malony-CoA,methymalonyl-CoA,succinyl-CoAあるいはCoenzymeAにより阻害されたが、palmitoy-CoAによっては阻害されなかった。

　第4章においては、A.brierleyiからのAcyl-CoA carboxylaseをコードする遺伝子のクローニングと配列解析について述べている。Southem hybridizationのためのDNAプローブは、BCとBCCPのそれぞれのアミノ末端のアミノ酸配列をもとに合成したプライマーを用い、PCRにより調製した。BCサブユニットはaocC(position2036-3565)によりコードされており、509アミノ酸残基から成っていた。また、BCCPサブユニットはaccB(position 3565-4068)によりコードされており、167アミノ酸残基から成っていた。なお、accBの開始コドンの初めのヌクレオチドはaccCのストップコドンの3番目のヌクレオチドと重なっていた。5番目のORF(pccB,position 4149〜5723)はカルボキシトランスフェラーゼ(CT)をコードしていた。本菌のAcyl-CoA carboxylase遺伝子のプロモーター配列、リボゾーム結合部位(RBS)、並びに転写終結シグナルはアーキアの既知の配列との比較によって同定された。結果としては、accCとaccBはオペロンとして、pccBは単独のmRNAとして転写されていることが示唆された。蛋白質のMultiple sequence alignment解析によっては、本菌由来のアミノ酸配列は、ユーカリアよりも寧ろバクテリアにより近いことが示された。

　第5章においては、Acyl-CoA carboxylase遺伝子の大腸菌変異株における機能的発現について述べている。E.coliJM109株を用いてACC遺伝子群を発現させた場合、極少量のBCCP蛋白質のみが可溶性画分もしくはインクルージョンボディー一画分に生産されるだけであった。一方、E.coliBL21(DE3)株を用いた場合には、著量のBCCPが可溶性画分に検出された。A.brierleyiのBCCPがE.coliのBCCPを相補できるか否かを決定するために、E.coli L 8[accB22(Ts)]を用いた実験を行ったが、A.brierleyiのBCCPを相補できないことが示された。最後に、recombinant酵素を活性型として得るために、E.coli BL21(DE3)株を用いて、accC-accBとpccBを別々に発現させることを試みた。この場合、BCとCTはインクルージョンボディーとして生産され、6 M guanidine-HClにより可溶化された。しかしながら、希釈並びに透析によるrenaturationの過程で蛋白質のaggregationが生じたため、可溶化蛋白質を再構成することは出来なかった。

　第6章においては、総括と展望を述べている。

　以上本論文は、3-ヒドロキシプロピオン酸サイクルの炭酸固定酵素に関して、生化学的・遺伝学的に多くの知見を得たものであり、学術上芯用上貢献するところが少なくない。よって審査員一同は、本論文が、博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。