光合成を行う細胞内小器官(オルガネラ)として知られ、植物細胞に最もその特性を与える葉緑体は、独自のゲノムと遺伝子発現系を持っている。オルガネラである葉緑体はその一生においてダイナミックに変化する。すなわち、プロプラスチドからの発達・分化に始まり、成熱、老化と続いていく間、形態的、機能的変化が連続的に起こり、核様体の構造や遺伝子発現の面でも大きな変化が観察される。以上のような過程は植物体の発生・分化・発達と共に起こり、内的プログラムに従う一方、光や水分、温度と言った外的環境変化にも応答しており、両プロセスが適切かつ巧妙に働くことにより葉緑体は正常に機能しうる。このようなことから・分化と環境応答といった2つの側面における葉緑体の転写レベルでの遺伝子発現制御の研究は重要である。

　葉緑体の転写装置としては、少なくとも2種の存在が知られている。一つは核コードのT3/T7ファージ型RNAポリメラーゼ(NEP,Nuclear-Encoded RNA Polymerase)であり・転写装置やリボソームといった遺伝情報の発現に関わる遺伝子等の転写に関与している。もう一方は、葉緑体ゲノム上にコードされる真正細菌型RNAポリメラーゼ(PEP,Plastid-Encoded RNA Polymerase)であり、主として光合成遺伝子の発現に関わる。PEPのコア酵素サブユニットの遺伝子群が葉緑体ゲノム上に存在するのに対し、コア酵素にプロモーター認識特異性を与えるシグマ因子の遺伝子は核染色体に存在する。シロイヌナズナにおいては、当研究室により6種のシグマ因子遺伝子(SIG1〜6)の存在が明らかにされている。これは、それぞれのシグマ因子が葉緑体の分化や環境ストレスに応じて、葉緑体の遺伝子発現を適切にコントロールしていることを示唆している。葉緑体ゲノムには光合成や脂肪酸合成、タンパク質分解、あるいは葉緑体自体の遺伝子発現に関与する、多くの重要栓遺伝子がコードされている。このことから、シグマ因子群を介した葉緑体遺伝子の転写制御を理解することは、光合成機能の構築・維持を含む葉緑体機能構造の制御機構の解明といった基礎的研究、およびそれに基づいた葉緑体機能の人為的操作といった応用的研究において、重要な課題であると考えられる。本研究では、分化・発達の過程および環境ストレス下での葉緑体機能発現制御における、シグマ因子の解析を目的とした。

1.葉緑体分化に関わるシグマ因子SIG2の機能解析

　シロイヌナズナにおいて、SIG2遺伝子のT-DNA挿入変異(sig2-1)株(以降、sig2-1と表記)が取得されている。この株では、暗所で育てた黄化植物体のプラスチド、すなわちエチオプラストの発達は野生型と同様であるが、葉などの緑色組織のプラスチド、すなわち葉緑体の発達は貧弱となることが示されている。これは、SIG2の標的である葉緑体ゲノム上の特定の遺伝子の発現が、葉緑体の分化・発達に重要であることを示唆している。そこで、SIG2依存的に転写される遺伝子を探索する目的で、葉緑体ゲノム上に存在するすべてのタンパク質遺伝子を網羅するマイクロアレイ(核コードの葉緑体遺伝子CAB,RBCSおよび、量的対照としてのアクチン遺伝子ACT2,λファージρ遺伝子を含む)を作成した。マイクロアレイのターゲットDNAは遺伝子の全長または一部領域をPCR法で増幅することにより取得し、これらをスライドグラスに4連でスポットした。このマイクロアレイを評価する目的で、生育7目目のシロイヌナズナ野生株(Col)より得た同一のtotaｌRNAを蛍光色素Cy3およびCy5を用いて標識し、バイブリダイゼーション実験を行った。その結果、Cy3シグナル強度およびCy5シグナル強度は同程度であり、当アレイによる解析の有効性が示された。

　このマイクロアレイを用い、生育7目目における、野生株とsig2-1間の遺伝子発現を比べた。その結果、sig2-1では79の全葉緑体コード遺伝子中、47遺伝子の発現が、シグナル強度で1.5倍以上上昇していた。この結果は、ノーザン法による解析結果とも一致していた。転写産物量が上昇していた遺伝子の多くは転写や翻訳などに関わる遺伝子群であり、NEPによって転写されると考えられているものと一致した。ただし、光合成に関わる遺伝子の発現も一部上昇しているのが観察され、NEPばかりではなくシグマ因子を含むPEPの活性上昇が予想された。そこで、生育4目目と7目目における、野生株とsig2-1間の、シグマ因子(SIG1,SIG3〜SIG6)およびNEP(RPOT3)の発現についてノーザン解析を行った。その結果、SIG4以外のシグマ因子は発現が上昇していた。しかしながら、NEPについてはその発現の上昇はわずかであった。このことより、sig2-1における一部の光合成系遺伝子の発現の上昇は、SIG2の欠損に対する相補的制御によるシグマ因子群の発現の増加によるものと考えられる。また、転写や翻訳等に関与する遺伝子群の発現の上昇は、NEP分子自体の活性の上昇によることが示唆される。通常、発達した葉緑体におけるNEPの転写活性は低く、SIG2がNEP分子の活性を抑制していることが考えられる。

　一方、マイクロアレイによる解析で転写産物量が減少していたのは、PSI-JサブユニットをコードするpsaJのみであった。この結果を踏まえて、psaJ ORFの全長(135nt)に対応するプローブを用いてノーザン解析を行ったところ、ポリシストロニックな転写産物(約1.5kb)およびモノシストロニックな転写産物(約0.3kb)の2種を検出し、約O,3kbの転写産物のみ発現量が減少していた。このために、SIG2依存のプロモーターはpsaJ ORFの直上流にあるものと推定されたそこで、S1マッピングを行ったところ、psaJ ORFの上流37ntの位置に転写開始点を、さらにその近傍に原核生物型のプロモーターに特徴的なコンセンサス配列、-35領域(TTGACA)-(N17〜19)-10領域(TATAAT)、に類似の配列を見出した。psaJプロモーターの-35領域および-10領域に相当する配列は、TGTACAおよびTACTATであった。当研究室による、SIG2の標的プロモーターの解析結果とあわせて、SIG2プロモーターのコンセンサス配列は、-35領域(TTNACA)-(N16〜17)-10領域(TANNNT)であることが推定される。以上のことより、psaJ遺伝子の発現にSIG2を含むPEPが関与することが示唆された。なおpsaJの他にも、本研究に先立って行われた当研究室における解析により、グルタミン酸tRNAを含む複数種の葉緑体tRNAの転写がSIG2に依存することが示されている。グルタミン酸tRNAがクロロフィル合成系の補因子として働くことや、psaJ遺伝子産物はクロロフィル結合タンパク質であることが、シアノバクテリアで示されていることから、SIG2は葉緑体の分化・発達において、クロロフィルの合成とその結合タンパク質の発現を共調させている可能性が示唆される。

2.SIG5遺伝子のストレス応答性の発見と機能解析

　移動することの出来ない植物は、環境の変化に対応するための機構を発達させている。葉緑体においても、光や酸化ストレスなどに対する応答機構が知られており、遺伝子発現を介した応答機構も知られている。ストレス環境下における、転写制御に関わるシグマ因子を同定する目的で、様々なストレス下でのシグマ因子の発現をノーザン法により解析した。ストレス処理は連続光下(50μE・m_2・s_1)、23℃、生育10日目のシロイヌナズナ野生株(Col)に対して行った。250mMNaClの塩ストレスを与えたところ、6つのシグマ因子のうち、SIG5の発現のみが、処理後2時間目から誘導された。これと同様の解析を暗適応させた植物体で行ったところ、光照射下と同様にSIG5の発現の誘導が見られた。従って、光の存在はSIG5のストレス応答性に必須ではない。ただし、暗所下での誘導は光照射下での誘導よりも遅く、4時間目から観察された。強光処理(50μE・m_2・s_1→500μE・m_2・s_1)での発現では、同様にSIG5のみで30分以内に強い誘導が見られた。低温処理(23℃→4℃)では、1時間目からSIG5の誘導が見られた。また、浸透圧ストレス(250mMマンニトール)でもSIG5の発現が、一時間目から誘導されていた。次に、SIG5プロモーター::uidA融合遺伝子を導入したトランスジェニック植物(遺伝背景、Col)を用いて、その発現をGUS染色法で観察した。その結果、比較的古い葉でSIG5プロモーターの強い発現が観察されたが、塩ストレス処理により、それまでほとんど発現していなかった若い葉でも、SIG5プロモーターの発現が誘導されることを見出した。以上のことは、SIG5がマルチストレス誘導型のシグマ因子であることを示している。

　続いて、ストレス応答時にSIG5依存的に転写される葉緑体遺伝子を探索する目的で、光合成遺伝子体(psaA,psbA,psbD,petA,atpA,)、転写装置遺伝子(rpoA,rpoB)、NAD(P)Hデヒドロゲナーゼ遺伝子(ndhB,ndhH)についてノーザン解析を行った。すると、PSII活性中心D2タンパク質遺伝子psbDの発現が、強光照射後3時間目から誘導されていた。同様に、psbDは塩ストレスで4時間後、低温では30分で誘導が観察された。また、psbDには複数の転写開始点の存在が知られるが、ストレスで誘導されるpsbD転写産物は、そのサイズから、青色光で誘導されることが知られるBLRP(Blue Light Responsive Promoter)からの転写によるものと考えられた。

　本研究ではさらに、SIG5遺伝子のT-DNA挿入変異(sig5-1)株の同定に成功した(以降、sig5-1と表記;遺伝背景,Col)。野生株(Col)およびsig5-1より得たtotalRNAに対しSIG5プローブを用いてノーザン解析をしたところ、野生株の正常型、SIG5mRNAのサイズは約2.0kbであるのに対し、sig5-1では検出されるmRNAのサイズ小さく約1.5kbであった。Sig5-1において、T-DNAはSIG5遺伝子上の中央部に導入されており、たとえ発現しているとしても、プロモーターの認識やコア酵素との結合に関与する保存領域を欠いている。これらのことから、sig5-1においてSIG5は機能していないと考えられる。塩ストレス付与後6時間でのpsbDの発現をノーザン法によって、野生株とsig5-1株間で比べたところ、野性株ではBLRPから転写されたと予想される転写産物の誘導が見られたのに対し、sig5-1では対応する転写産物が見られなかった。このことは、BLRPの認識にSIG5が必要であることを示している。psbDの遺伝子産物はPSII活性中心のD2タンパク質であり、様々なストレスによって光合成電子伝達系に不備が生じた場合に、もっとも大きな損害を受けるものであると考えられる。SIG5による遺伝子発現制御は、ストレス下で損傷した光合成活性中心の修復に関わっていることが示唆される。

まとめ

SIG2について

　葉緑体の分化・発達に関わるRNAポリメラーゼシグマ因子SIG2の標的遺伝子をマイクロアレイにより探索し、既報の複数のtRNAに加え、psaJ遺伝子がその制御下にあることを見出した。また、同マイクロアレイ解析により、葉緑体転写制御系に対するSIG2欠損の影響は大きく、シグマ因子群の発現の上昇や、NEP分子の活性の上昇を引き起こしている可能性が示唆された。葉緑体の分化には、SIG2によるクロロフィル合成と、その結合タンパク質の共調的発現の制御、およびNEPの活性抑制が重要であると考えられる。

SIG5について

　強光、低温、塩、浸透圧といった、環境ストレスに応答するシグマ因子としてSIG5を同定し、SIG5のストレス応答性に光は必須でないことを示した。葉緑体ゲノムに存在するpsbD遺伝子のBLRP(Blue Light Reponsive Promoter)からの転写も、同様のストレスに応答することを見出した。さらに、SIG5遺伝子のT-DNA挿入欠損株の解析から、SIG5の標的遺伝子のひとつがpsbD遺伝子であり、BLRPからの転写に関与することを示した。以上より、ストレスにより損傷した葉緑体機能の修復に、SIG5が関わっていることが示唆された。

　光合成を行う細胞内小器官(オルガネラ)として知られ、植物細胞の特性の多くを担っている葉緑体は、独自のゲノムと遺伝子発現系をもっている。葉緑体の構造や機能は植物個体の組織や器官の分化に対応し、あるいは光その他の環境変化に速やかに応答してダイナミックに変化する.植物の光合成装置である葉緑体は、同じ酸素発生型の光合成を行う真正細菌シアノバクテリア(らん藻、cyanobacteria)がかつて別の真核細胞内に共生したことに起源を持つとされている.実際、葉緑体ゲノムに含まれる遺伝子群の構成、構造、機能はシアノバクテリアに極めて良く似ており、そこでは基本的に真正細菌型の転写、翻訳装置が働いている.本研究は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を材料として核と葉緑体ゲノムからなる複合ゲノム系における葉緑体分化・発達の過程及び環境ストレス応答時における葉緑体におけるシグマ因子の関与について解析した結果をまとめたものであり、5章よりなる。

　第一章は、研究の背景について述べており、葉緑体における環境応答、遺伝子発現の転写、転写後、翻訳レベルにおける制御機構などについて今まで知られている知見を整理している.近年、シロイヌナズナの葉緑体ではNEPとPEPと呼ばれる2つの転写系が動いており、PEPの構成分としてSIG1〜SIG6の6個核遺伝子の存在が明らかにされている.第二章では、核遺伝子SIG2をT-DNA挿入によって破壊した株(sig2-1)と親株(野生株)の芽生え期における葉緑体ゲノム遺伝子群の発現を特製のマイクロアレイを用いて解析した結果について述べている.このマイクロアレイは、葉緑体ゲノム上の全ての蛋白質コード遺伝子(79遺伝子)と核コードのCAB,RBCS、及び対照としてアクチン遺伝子(ACT2)、λファージのQ遺伝子を解析対象としたものである.生育7日目の野生株とsig2-1株の全RNAを蛍光色素Cy3およびCy5で標識し、発現量の比較を行った結果、79遺伝子のうち47個について1.5倍以上の上昇が認められた.一方、光化学系1の構成蛋白質の遺伝子の一つであるpsaJについては転写発現量の減少が認められた.psaJ遺伝子のmRNAをS1マッピングによって調べたところプロモーター領域に真正細菌のコンセンサスプロモーター配列と類似の-35,-10エレメントを見いだした.マイクロアレイによる転写発現の結果はノーザン解析によって確認された.第三章は、6個の核コードシグマ因子遺伝子のうちでSIG5遺伝子が塩、強光、低温、酸化などのストレス処理後1〜2時間内に転写発現量が増大することを述べている.このようなストレス応答には光の存在は必ずしも必須ではない.SIG5遺伝子のプロモーターにuid遺伝子を融合した系を用いて調べた結果、SIG5の発現は比較的古い葉で強く認められたが、ストレス応答下では若い葉でも強い発現が認められた.これらのことはSlG5がマルチストレス誘導型のシグマ因子であることを示している.第四章では、光形態形成変異(det,cop)、光受容体変異(phy,cry,hy),プラスチドシグナル変異(gun)によるSIG5を介したストレス応答への影響について解析した結果を述べている.また、SIG5のT-DNA挿入破壊株(sig5-1)の取得とこの株を用いてSIG5標的遺伝子の解析を行った結果、BLRP(blue light response promoter)からの発現にSIG5が関与しいていることが示唆された.第五章は、総合討論である.

　以上要するに本論文は、マイクロアレイ解析により核コードのシグマ因子の一つSIG2の標的プロモーターとしてpsaJを発見するとともに、別のSIG5がマルチストレス誘導型のシグマ因子であることを明らかにしたものであり、学術上、応用上寄与するとことが少なくない。よって審査員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。