アポトーシスは細胞死の一つの形態であり，細胞増殖，分化と同様，正常な個体の発生やその維持において重要な役割を担っている。アポトーシスを起こしている細胞ではカスパーゼと呼ばれる一群のシステインプロテアーゼの活性化が認められ，種々の基質を切断することにより細胞死を実行する。哺乳動物におけるアポトーシス誘導には二つの経路が存在する。一つはFasなどに代表される細胞表面受容体を介する経路で，もう一つはミトコンドリアを介した経路である(左図参照)。どちらの経路においても，細胞内外からの細胞死誘導シグナルはカスパーゼ活性化という細胞死シグナルへと変換，増幅されて細胞死を実行する。Fasリガンドや細胞傷害性抗FaS抗体によりFaSが刺激されると，Fasの重合に伴って細胞死誘導複合体(DISC)が形成される。DISCはFas，カスパーゼ-8およびアダプター分子FADDから構成されている。DISC上で自己切断，活性化したカスパーゼ-8は，下流のカスパーゼ-3，7を切断，活性化する。一方，UV照射，薬剤処理などのストレスに曝露された細胞では，ミトコンドリアの膜電位消失に伴ったシトクロムc漏出が認められる。シトクロムcはdATP，アダプター分子Apaf-1と共にApoptosomeと呼ばれる複合体を形成する。同複合体上で自己切断，活性化したカスパーゼ-9は，下流のカスパーゼ-3，7を切断，活性化する。また，ある種の細胞ではFasを介したアポトーシスの際，このミトコンドリアを介したカスパーゼ活性化を主要な経路としている。こうした細胞ではカスパーゼ-8によるBIDの切断が細胞死実行に必要である。切断されたBID(tBID)はミトコンドリアヘ移行し，膜電位消失，シトクロムc漏出を誘導する。

　ヒト単芽球様細胞U937はインターフェロン・ガンマ(IFN)，活性型ビタミンD3(VD3)および全トランスレチノイン酸(RA)処理によりCD11b陽性の単球・マクロファージ様細胞へ分化することから，食細胞分化のモデル細胞として広く用いられている。以前当研究室において，これら分化した細胞がFaSを介したアポトーシスに対して異なる感受性を示すことが見出された(Kikuchi et al., J Leuc　Biol. 60，778-783)。つまり，lFN処理細胞(IFN-U937)は未分化細胞に比べて高感受性を示したのに対し，VD3およびRA処理細胞(それぞれVD3-U937，RA-U937)は耐性を獲得していた。末梢血単球由来マクロファージもFasを介したアポトーシスに対して耐性を示すことが後に報告されており，U937に特異的な表現型でないことが明らかとなっている。本研究ではU937の食細胞分化に伴ったFas刺激に対する感受性変化のメカニズム解明を目指して解析を行った。

　これまでアポトーシスの指標としてアポトーシス細胞に特徴的な形態変化を用いてきたが，本研究では細胞死実行に関与するカスパーゼの活性化を指標に解析を進めた。未分化U937は，細胞傷害性抗Fas抗体(CH-11)処理によりアポトーシスを起こす。その細胞抽出液には活性化したカスパーゼが存在するため，蛍光基質(Ac-DEVD-MCA)の切断に伴った蛍光強度増大が認められる。IFN-U937においてはカスパーゼ活性化が未分化細胞に比べて顕著に増大していたが，Fas耐性を示すVD3-およびRA-U937においては全く検出されなかった(左図参照)。イムノブロットによる解析からも，活性化を伴うカスパーゼー3，7，8のプロセシングおよびそれに伴った基質poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)，BIDの切断がアポトーシス細胞において検出された。一方，FaS耐性細胞では一切，認められなかった。以上の結果より，細胞分化に伴ったU937のFas感受性の変化は，カスパーゼ活性化のレベルで起きていることが明らかとなった。

　Fas耐性を示す数多くの細胞において，FLIPの発現量増大が認められる。FLIPはカスパーゼ-8に類似した構造を持つが，プロテアーゼ活性を有しないため，内在性ドミナントネガティブとして機能している。FLIP自身はDISC上でのカスパーゼ-8活性化を促進するが，その際に生じる切断断片は近傍で新たに起こるカスパーゼ-8活性化を阻害する。したがって，発現量増大によるFas耐性化は，DISC上での切断断片の蓄積によるものである。VD3処理によるFLIP発現量増大は一過性であったのに対し，RA処理では定常的にFLIP発現量増大が認められFas耐性化へのFLIPの関与が期待された。そこでFLIPの機能解析を目指し，FLIP切断部位特異抗体(#1342-Ab)を作成した。同抗体はカスパーゼ-8による切断で生じたFLIP断片の切断末端を特異的に認識する抗体である。また，カスパーゼ-8自己切断末端に対する特異抗体も作成した(#791-Ab)。同抗体の切断部位特異性は，種々の合成ペプチドを用いたELISA，および組み換えタンパク質，細胞抽出液を用いたイムノブロットにより確認されている。同抗体をフローサイトメトリーへ応用することにより，各細胞におけるカスパーゼ-8のプロセシングおよびFLlPの切断の度合いや切断の認められた細胞の割合に関する情報を得ることができた(Niikura et a1.，J Biochem. 132，53-62)。興味深いことに，切断の認められた細胞における縦軸の蛍光強度の増大(抗体結合量に呼応)は，Fas感受性に関わらず一定であった。これは細胞当たりの切断断片量が同じであること示しており，細胞内シグナルの強度が同程度であることを示唆するものであった(左図参照)。VD3-およびRA-U937において認められたカスパーゼ-8切断陽性細胞はごく僅かであり，これらFas耐性細胞ではDISC上でのカスパーゼ活性化が全く起きていない，もしくはその後のミトコンドリアを介したシグナル増幅が行われていないと推測された。また，FLIP切断も一部の細胞にしか検出されず，Fas耐性化へのFLIPの関与は認められなかった。

　前述の通り，Fas刺激初期のカスパーゼ-8活性化が微弱であった場合，細胞死を実行するのにシグナルを増幅する必要がある。U937におけるDISCは非常に不安定であり，そこで活性化されるカスパーゼ-8はごく僅かである。したがって，ミトコンドリア経路はDISC形成と同様，U937のFas感受性に大きな影響を及ぼす。その経路は単離したミトコンドリアを細胞質画分に懸濁，活性化したカスパーゼ-8(His-p30)を添加することによりin vitroで再現することができ，His-p30添加に伴ったミトコンドリア膜電位の消失，およびシトクロムcの漏出が観察される(左図参照)。Rhodamine123(Rh123)は膜電位依存的に取り込まれる蛍光色素で，膜電位消失に伴いミトコンドリアから漏出する(蛍光強度増大)。これはカスパーゼ阻害剤(z-VAD-fmk)により抑制され，カスパーゼ-8活性に依存した現象であることが確認された。分化誘導した各細胞より単離したミトコンドリアを用いて解析した結果，いずれのミトコンドリアもカスパーゼ-8活性に反応してシトクロムc漏出する機能を保持していた。シトクロムc漏出後に起こるApoptosomeを介したカスパーゼ活性化もいずれのサンプルにおいて同程度検出されたことから，各分化細胞においてミトコンドリア経路が機能していることが直接的に明らかとなった。これはFas刺激初期にカスパーゼ-8が活性化されれば，ミトコンドリア経路を通じて同じようにシグナルは増幅され，細胞死が実行されることを示唆するものであった。

　ここまでの実験より，細胞分化に伴ったFaS感受性の変化がミトコンドリアを介したシグナル増幅経路の変化によるものでないことが明らかとなっている。そこでシグナルの入口であるFasの解析を行った。Fas感受性変化と対応するようにIFN-U937においてはFas発現量の増大が，一方Fas耐性を示すVD3-およびRA-U937では発現量の減少が認められた(左図参照)。Fas刺激に伴ったFasの重合の解析を試みたところ，未分化およびlFN-U937においてFas重合による点状の蛍光が細胞表面で認められた。一方，VD3-およびRA-U937においてはFas重合が減弱していた(左図参照)。

　ZB-4は非細胞傷害性抗Fas抗体であり，CH-11のFaSへの結合を阻害する中和抗体として用いられている。したがって，ZB-4で段階的にFasを中和することで，CH-11が結合しうるFasの数を制御することができる。そこでVD3-およびRA-U937におけるFas発現量(CH-11結合量)と比較しながら，CH-11結合量の変化がFas重合に及ぼす影響を検討した(右図参照)。その結果，ZB-4(20ng/mL)処理細胞(VD3-U937に相当)においてFasの重合が顕著に抑制され，Fas耐性細胞における重合の減弱がFas発現量減少によるものであることが明らかとなった。

　最後にFas直下のシグナリングを解析するため，各分化細胞からのDISC単離を試みた。その結果，未分化およびIFN-U937において，Fas刺激に伴ったカスパーゼ-8のFasへの結合が認められた(右図参照)。一方，VD3-およびRA-U937においては減弱していた。当初，Fas耐性化への関与が期待されたFLIPは，Fas耐性細胞より単離したDISC中には検出されず，むしろFas高感受性を示すIFN-U937において認められた。DISC上のFLIPは速やかにカスパーゼ-8にて切断され，DISCから解離していることが明らかとなり，カスパーゼ-8活性化促進に機能していることが示唆された。

　以上より，ヒト単芽球様細胞株U937の食細胞分化に伴ったFas感受性の変化は，Fasの量的変化を初めとするFas近傍における変化によるものであることが示唆された。

1:細胞障害性抗Fas抗体(CH-11)

2:スタウロスポリン，UN照射

Ac-DEVD-MCA切断活性

分化誘導した各細胞へCH-11を添加してアポトーシスを誘導した。作成した切断部位特異抗体を用いて、カスパーゼ-8およびFLIPの切断を経時的にフローサイトメトリーにより解析した。縦軸は切断に呼応したFITCによる蛍光強度、横軸はP1染色よるDNAの状態を示す。

ミトコンドリア依存カスパーゼ活性化機構の解析

(A)未分化U937より調製したミトコンドリアを可溶性画分に懸濁、活性型カスパーゼ-8(His-p30)を添加してミトコンドリア膜電位変化を測定した。膜電位の測定にはRhodamine123(Rh123)を用いた。(B-D)各分化細胞から調製したミトコンドリアおよび可溶性画分を用いて同擦の実験を行った。(B)IFN-U937、(C)3VD-U937、および(D)RA-U937。

ZB-4によるFas発現量およびFas重合の制御

(A)ZB-4の使用濃度(20，100ng/mL)を変えることにより，CH-11が結合できるFasの数(見かけのFas発現量)を制御した。ZB-4前処理は培養条件下で1時間行った。横軸はFas発現量に呼応したFITC lこよる蛍光強度を示す。青はコントロール，緑は未処細胞，赤はZB-4処理細胞を示す。(B)各細胞を。CH-11にて刺激し，Fas重合を誘導した。矢印はFasの重合が認められた細胞を示す。核はT0・PR03(blue)にて染色した。

　本研究は初期免疫において重要な役割を担っている単球・マクロファージの細胞分化ならびに細胞死の制御機構を明らかとするため，ヒト単芽球様細胞株U937をインターフェロン・ガンマ(lFN-γ)や活性型ビタミンD3(VD3)，全トランスレチノイン酸(RA)などにより分化誘導する系を用いて，食細胞分化に伴った細胞死受容体FaSを介したアポトーシスに対する感受性の変化について解析を試みたものであり，下記の結果を得ている。

1．カスパーゼ-8およびその基質FLIPに対する切断部位特異抗体を作製し，カスパーゼ-8活性化をin situにて検出する系を確立した。フローサイトメトリーによる解析の結果，FaS感受性変化は刺激初期におけるカスパーゼの活性化，もしくはその後のミトコンドリアを介したシグナル増幅の変化に基づくものあることを示した。

2．単離ミトコンドリア，細胞質画分，および活性型カスパーゼ-8を用いたin vitroでの解析より，細胞分化に関わらずいずれのミトコンドリアもカスパーゼ8/BIDの経路でシトクロムcを放出する機能は保持していることが明らかとなった。

3．シトクロムc添加に依存したカスパーゼ活性化は分化誘導した各細胞抽出液において同程度検出されたことから，ミトコンドリアからシトクロムcが放出されればFaS感受性に関わらず同程度のカスパーゼ活性化が起こることが明らかとなった。以上より，Fas感受性変化はミトコンドリアを介したシグナル増幅経路における機能的変化によるものでなく，刺激初期におけるカスパーゼ活性化の変化によるものであることが示唆された。

4．Fas感受性と相関するように，IFN-γ処理細胞においてFasの発現量が増加していたのに対し，VD3およびRA処理細胞においてはFasの発現量は減少していた。興味深いことに，VD3およびRA処理細胞においてはFasにより誘導されるFasの重合が著しく減弱しており，非細胞傷害性抗FaS抗体を用いた競合実験により，この減弱がFas発現量の減少によるものであることが明らかとなった。

5．Fas刺激に依存したDISC形成能を解析した結果，VD3およびRA処理細胞においてDISC形成能が減弱していた。一方，IFN-γ処理細胞におけるDISC形成能は未分化細胞と同程度であり，DISC形成能ではFas高感受性を説明することはできなかった。

6．IFN処理細胞より単離したDISC中にFLIPのバンドを見出した。FLIPがDISC上におけるカスパーゼ-8活性化を促進することがすでに報告されており，IFN処理細胞におけるFas高感受性へのFLIPの関与が示唆された。

　以上，本論文はヒト単芽球様細胞株U937において，食細胞分化に伴いFasが量的また機能的に変化することを見出した。本研究はこれまで不明であったマクロファージにおけるFas耐性のメカニズムおよびその意義を解明する上で重要な貢献をなし，免疫学の発展に寄与するところが大きい。したがって，本論文は学位の授与に値するものと考えられる。