インテグリンは接着分子の中の1つのファミリーであり、細胞間あるいは細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用に重要な働きを担っている。インテグリンに関する報告は数多くなされており、細胞接着、遊走、細胞分化・増殖、さらには細胞死にまで関与していると言われている。インテグリンファミリーの中で最も多様な亜群を形成しているのは、β1インテグリンである。β1インテグリンはそのリガンドであるフィブロネクチンやコラーゲンと結合することにより、多数の細胞内蛋白質をチロシンリン酸化させ、細胞内にシグナルを伝達している。そのインテグリン刺激によってリン酸化される蛋白質の一つにCas(Crk-associated substrate)がある。Casは元々癌遺伝子v-crkによる形質転換細胞内チロシンリン酸化蛋白質として同定されたアダプター分子であり、動物の発生、炎症、癌の浸潤・転移などに重要な役割を担っている。Casのノックアウトマウスは心臓低形成による全身鬱血と成長遅延により胎生11.5日に死亡する。

　Cas-L(Cas-lymphocyte type)はCasファミリーの1つであり、β1インテグリンによりチロシンリン酸化される105KDの蛋白として同定された。また同時に出芽酵母に偽菌糸を誘導する蛋白質としても同定され、HEF1(human enhancer of filamentation)としても知られている。Cas-LはN末端にSH3領域、続いて基質領域、セリン豊富領域、そしてC末端にヘリックスターンヘリックス領域があり、Casとの強い相同性を保持している。しかしながら、Casが全身の細胞に発現しているのに対して、Cas-Lはリンパ球と一部の上皮細胞に発現が限局しているのが特徴である。現在までの研究でCas-Lは接着斑でのアダプター分子としての機能に加えて、細胞核内に移行して、細胞周期やアポトーシスに関与していることも明らかにされている。また、T細胞上ではインテグリンを介してのT細胞受容体(TCR)刺激のco-stimulation(副刺激)に作用するだけではなく、LckやFynに結合して、TCRからのシグナル伝達に直接関与することも分かっている。B細胞における解析は比較的少ないが、B細胞受容体(BCR)刺激により直接チロシンリン酸化されることが報告されている。

　従来のCas-Lの研究はすべて細胞レベルでの解析であり、本研究で私はCas-Lノックアウトマウスを作成することにより、生体内でのCas-L遺伝子の機能を解析することを試みた。

　ノックアウトマウスはCas-L遺伝子N末端のSH3領域をコードするエクソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換することにより作成された。Cas-Lノックアウトマウスは、正常に出生し、外観、血算、各臓器の組織学的検査では異常は認められなかった。次に骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、腹腔洗浄液、および末梢血に関して、Flow cytometryを用いた一般的なリンパ球分画の解析を行った。脾臓において総細胞数の軽度減少が認められた以外は、コントロールマウスに比べて明らかな違いは認められなかった。

　一般にB細胞は、骨髄で細胞表面にIgMを呈した未熟B細胞まで分化すると、その分化の場所を脾臓に変える。脾臓では未熟B細胞は濾胞B細胞(IgD陽性、IgM弱陽性)およびmarginal zone B細胞(IgD陰性、IgM陽性)へとさらに分化し、前者は白脾髄の濾胞部分に、後者は白脾髄と赤脾髄の境界の辺縁帯とよばれる部分に局在する。Cas-Lノックアウトマウスに関して末梢B細胞の分化を解析したところ、marginal zone B細胞の消失が明らかとなり、同時に濾胞B細胞の軽度増加が認められた。このmarginal zone B細胞の消失を組織レベルで確認するため、免疫染色を行った。IgM陽性、IgD陰性細胞であるmarginal zone B細胞がコントロールマウスでは認められるのに対して、ノックアウトマウスでは消失していることが確認された。

　このmarginal zone B細胞の消失が血球系細胞由来のものであるのか、あるいは支持組織などの環境因子によるものであるのかを鑑別するため、骨髄移植実験が施行された。その結果、野生型マウスに移植されたノックアウトマウス由来の骨髄からはmarginal zone B細胞はほとんど検出されなかったが、ノックアウトマウスに移植されたコントロールマウス由来の骨髄からは正常にmarginal zone B細胞が認められた。従って、Cas-Lノックアウトマウスにおけるmarginal zone B細胞の消失はCas-L欠損B細胞自身に由来することが分かった。

　現在までにmarginal zone B細胞が消失する表現型を示した遺伝子改変マウスは多数報告されている。未だその消失の原因は明らかとはなっていないが、いくつかの可能性が示唆されている。第1の可能性は、marginal zone B細胞の前駆体の消失によるものである。BAFFあるいはBAFF-Rのノックアウトマウスでは未熟B細胞以降の分化が止まっており、濾胞B細胞が消失することでmarginal zone B細胞も消失したものと考えられている。第2の可能性はBCRからの刺激の強さによって、濾胞B細胞とmarginal zone B細胞の分化の振り分けが決定するというものである。AiolosのノックアウトマウスやNotch-RBP-JのB細胞特異的ノックアウトマウスで提示された仮説であり、著者らは何らかのnegative regulatorの関与を指摘している。第3はmarginal zone B細胞の局在部位である辺縁帯への遊走と接着が障害された結果、marginal zone B細胞が保持できないという可能性であり、Pyk2あるいはDock2のノックアウトマウス等により提示された。今回私が作成したCas-Lノックアウトマウスは、marginal zone B細胞以外明らかな異常を呈していないことから、第1の可能性は否定されるものと考えられる。第2の可能性に関しては、Cas-LがLynと結合してBCRからのシグナル伝達に関与していることを考慮すれば、否定はできない。従ってCas-Lノックアウトマウスにおいて、BCRを介したシグナル伝達に異常がないかを検索するため、各種抗原刺激に対する細胞内カルシウム濃度の測定とB細胞増殖実験を行った。その結果、BCRからのシグナル伝達に明らかな異常は認められなかった。

　第3の可能性である辺縁帯への移動と同部への接着異常は、細胞レベルでの解析によりCas-Lが発現していないT細胞では著しく遊走能が低下するという報告があることから最も可能性が高いと考えられた。まず私はCas-Lノックアウトマウスのリンパ球の遊走能を確認するため、末梢リンパ球に対する強い遊走活性化因子であるSDF(Stremal cell derived factor)-1αとBLC(B-lymphocyte chemokine)を用いた遊走実験を試みた。その結果、Cas-L欠損B細胞で明らかに遊走能が低下していることが分かった。さらに辺縁帯での接着能が正常か否か確認するため、辺縁帯における接着に関連していると考えられているICAM-1(intracellular adhesion molecule-1)とVCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)を用いて解析を行ったところ、予想どおり接着能の低下が認められた。これらの機能低下が各種ケモカインや接着因子に対する受容体の発現の低下と関連しているかどうか調べるため、flow cytometryにより各分画ごとに各種受容体の発現を調べた。その結果、インテグリン受容体の発現はどの分画でも明らかな差異は認められなかったが、SDF-1αの受容体、CXCR4はmarginal zone B細胞で有意に上昇していることが判明した。このデータの再確認のため、メッセンジャーRNAレベルでのCXCR4の発現を定量PCRで調べたところ、flow cytometryの結果と同様、ノックアウトマウスで発現の上昇が認められた。

　以上の解析より、Cas-Lはmarginal zone B細胞の維持に重要な役割を担っており、Cas-Lノックアウトマウスにおけるmarginal zone B細胞の消失は、辺縁帯への遊走および同部への接着異常により生じているものと考えられた。辺縁帯への接着が低下することにより、marginal zone B細胞が脾臓外へ流出する可能性も考えられたが、他部位でのmarginal zone B細胞の異常増加は認められておらず、私は辺縁帯での接着以前の、同部への移動の障害が最大の原因ではないかと考えている。辺縁帯への遊走のメカニズムは未だ解明されていないが、今回、私の解析でCas-Lノックアウトマウスのmarginal zone B細胞において、CXCR4の発現が著明に上昇していることは、SDF-1αの関与を強く示唆するものである。

　本研究は接着分子であるインテグリンの下流にあるアダプター分子Cas-L(Crk-associated substrate lymphocyte type)がリンパ球の分化・機能においてどのように作用しているかを個体レベルで明らかにするため、遺伝子欠損マウスを作製することによりその生理的役割を明らかにしたものである。以下のような結果が得られた。

1 Cas-Lノックアウトマウスは、正常に出生し、外観、血算、各臓器の組織学的検査では異常は認められなかった。骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、腹腔洗浄液、および末梢血に関して、Flow cytometryを用いた一般的なリンパ球分画の解析を行ったところ、脾臓において総細胞数の軽度減少が認められた以外は、コントロールマウスに比べて明らかな違いは認められなかった。しかしながら、末梢B細胞の分化を解析したところ、marginal zone B細胞の消失が明らかとなり、同時に濾胞B細胞の軽度増加が認められた。このmarginal zone B細胞の消失を組織レベルで確認するため、免疫染色を行ったところ、IgM陽性、IgD陰性細胞であるmarginal zone B細胞がコントロールマウスでは認められるのに対して、ノックアウトマウスでは消失していることが確認された。

2 marginal zone B細胞の消失が血球系細胞由来のものであるのか、あるいは支持組織などの環境因子によるものであるのかを鑑別するため、骨髄移植実験を施行した結果、野生型マウスに移植されたノックアウトマウス由来の骨髄からはmarginal zone B細胞はほとんど検出されなかったが、ノックアウトマウスに移植されたコントロールマウス由来の骨髄からは正常にmarginal zone B細胞が認められた。従って、Cas-Lノックアウトマウスにおけるmarginal zone B細胞の消失はCas-L欠損B細胞自身に由来することが明らかとなった。

3 B細胞受容体(BCR)を介したシグナル伝達に異常がないかを検索するため、各種抗原刺激に対する細胞内カルシウム濃度の測定とB細胞増殖実験を行った。その結果、BCRからのシグナル伝達に明らかな異常は認められなかった。

4 Cas-Lノックアウトマウスのリンパ球の遊走能を確認するため、末梢リンパ球に対する強い遊走活性化因子であるSDF-1αとBLCを用いた遊走実験を試みた結果、Cas-L欠損B細胞で明らかに遊走能が低下していることが分かった。さらに辺縁帯での接着能が正常か否か確認するため、辺縁帯における接着に関連していると考えられているICAM-1とVCAM-1を用いて解析を行ったところ、予想どおり接着能の低下が認められた。

5 遊走能や接着能の低下が各種ケモカインや接着因子に対する受容体の発現の低下と関連しているかどうか調べるため、flow cytometryにより各分画ごとに各種受容体の発現を調べた。その結果、インテグリン受容体の発現はどの分画でも明らかな差異は認められなかったが、SDF-1αの受容体、CXCR4はmarginal zone B細胞で有意に上昇していることが判明した。このデータの再確認のため、メッセンジャーRNAレベルでのCXCR4の発現を定量PCRで調べたところ、flow cytometryの結果と同様、ノックアウトマウスで発現の上昇が認められた。

　以上、申請者の研究は、インテグリン下流のアダプター分子であるCas-L遺伝子がmarginal zone B細胞の維持に不可欠であることを明らかにした。Marginal zone B細胞は近年、初期免疫に関与する特異的なB細胞分画であることが明らかになってきており、申請者の研究はその維持において細胞接着が重要な役割を担っていることを個体レベルで示した初めての研究である。従って、当研究は学位の授与に十分値するものと考えられる。