生物の初期発生では、基盤となる未分化な幹細胞群が誘導を受ける事で、様々な組織や臓器を形成する細胞に分化し個体を形成していく。特に生殖細胞は体細胞とは異なり、生命体の遺伝情報を次世代に継代し、種における遺伝的多様性を確保するために極めて重要な細胞である。生殖細胞は初期発生においてまず予定始原生殖細胞(presumptive primordial germ cell: pPGC)として生殖巣原基(genital ridges)に移動し、生殖細胞の幹細胞と言うべき始原生殖細胞(primordial germ cell: PGC)に分化する。その後、精原細胞(spermatogonia)または卵原細胞(oogonia)として分化し、減数分裂を経てそれぞれ精子(sperm)または卵子(ovum)に最終分化する事で受精能を獲得する。移動期にあるpPGCは胚性生殖細胞(Embryonic Germ cells: EG cells)としてマウスにおいて樹立されているが、アフリカツメガエル(Xenopus)においては樹立されていない。しかしながら、XenopusにおいてpPGCを単離しEG様細胞を樹立できれば、全能性を保持した胚性幹細胞(Embryonic Stem cells: ES cells)が存在しないXenopusにおいても培養系で継代する事ができ、遺伝子変換を施した生殖細胞系譜を作製する事ができる。さらに、Xenopus laevisの近縁種でありゲノムの倍数性が2倍体(2n=20)であるXenopus tropicalisにおいてEG様細胞を樹立し、細胞移植によって生殖細胞系譜に組み入れる事ができれば、今まで不可能と思われていた標的遺伝子相同組み換え変異体ができる可能性がある。発生期における細胞・組織移植などの人為的操作やその追跡に加え、哺乳類では胎性致死になり解析が困難な遺伝子の解析も比較的容易なXenopusにおいて標的遺伝子相同組み換え技術を確立する事は、幹細胞の発生・分化などを含む初期発生機構の解明に多大な貢献をし得るだろう。

　本研究では、標的遺伝子相同組み換え技術の確立に先立ち、大部分の生物種に存在し且つ遺伝情報を次世代に継代しうる唯一の細胞系譜である生殖細胞系譜からEG様細胞を樹立するため、まず、X. tropicalisのpPGCを特異的に可視化する事を目的とした。しかしながら、X. tropicalisにおける生殖細胞系譜の発生様式は遺伝子発現も含めほぼ未知であったため、近縁種であるX. laevisの母性因子である生殖細胞質(germ plasm)を含むpPGCに特異的に発現するDAZ遺伝子(Xdazl)に注目した。DAZ遺伝子の相同遺伝子はヒトやマウスなど多くの生物種で確認されており、機能としてはpPGCを生殖巣原基に移動させ、精原細胞や卵原細胞における減数分裂に関与している事が知られている。これらの知見から、Xdazlの部分的DNA断片をプローブとし、X. tropicalis cDNA・ライブラリーをスクリーニングした結果、X. tropicalis DAZ-like gene(Xtdazl)の単離に成功した。全長配列の決定により、XtdazlはX. laevisのXdazlと比較するとアミノ酸レベルで75%、塩基レベルで61%の相同性があり、DAZ family特有のDAZ-motifとRNP (RNA-binding protein) -domainが存在する事がわかった。各発生段階におけるX. tropicalis胚からmRNAを抽出し、RT-PCRによりXtdazl mRNAの時期的発現を調べた結果、(未)受精卵、胞胚、原腸胚、神経胚、尾芽胚、初期幼生期において発現が確認できた。成体組織においては体細胞組織には発現が見られず、精巣と卵巣にのみ発現が見られた。加えて、Whole-mount in situ hybridizationによりXtdazl mRNAの空間的発現を追跡した結果、X. laevisでの知見におけるpPGCの局在とXtdazl mRNAの発現は一致していた。具体的に述べると、Xtdazl mRNAはSt. I前卵黄蓄積期卵母細胞から発現しており、METRO(message transport organizer)領域から植物極に局在後、受精による卵割を経て胞胚腔へ発現が移行する。その後、Xtdazl mRNA発現細胞は神経胚形成期を通じて原腸直下に停滞しているが、尾芽胚期から初期幼生期に至るまでに内胚葉の最上部(dorsal crest)に移動する。これらの観察結果より、XtdazlはX. tropicalisのpPGCにおいて特異的に発現する遺伝子であると結論付けられるため、X.tropicalisの生殖細胞系譜を追跡する最初の遺伝子マーカーとして有用である。

　さらに、XtdazlがX.tropicalisのpPGCに特異的に発現する事から、個体を生存させたままpPGCを可視化するためにXtdazlプロモーターを探索した。Xtdazlの部分的DNA断片をプローブとして、X.tropicalisゲノム・ライブラリーをスクリーニングした結果、Xtdazlの転写開始点を含む推定プロモーター領域(約5kbp)を得る事ができた。Luciferase Assayによりプロモーター活性を確認後、生体内における空間的発言を確認するため、この推定プロモーター領域にレポーター遺伝子(EGFP: enhanced green fluorescent protein)とmRNAの局在化に必要なXtdazlの3'UTR(untranslated region)を組み込んだプラスミドを構築し遺伝子導入胚を作製した。Xtdazl-3'UTRを組み入れた理由は、Xtdazl-3'UTRを含まずに遺伝子導入すると、転写されたEGFP mRNAが生殖細胞質を保持しうる植物極側の細胞に含まれない可能性があり、移動期にあるpPGCを特異的に可視化できなくなる可能性があるためである。その遺伝子導入胚を幼生期または若成体期において観察した結果、ほとんどの胚において頭部や腎管などに異所的な発現が見られ、pPGC特異的な発現は見られなかった。以上の結果はpPGCを特異的に可視化するには単離したXtdazl推定プロモーター領域だけでは不十分であり、更にXtdazl部位特異的エンハンサー領域が必要である事を示唆している。

　本論文は2章からなる。第1章はアフリカツメガエル(Xenopus tropicalis)の生殖細胞関連遺伝子XtdazlのクローニングとpPGCの可視化について、第2章はXtdazl遺伝子のプロモーター探索と解析について述べられている。

　生殖細胞は初期発生においてまず予定始原生殖細胞(presumptive primordial germ cell: pPGC)として生殖巣原基に移動し、始原生殖細胞に分化する。その後、精原細胞または卵原細胞として分化し、減数分裂を経てそれぞれ精子または卵子に最終分化する事で受精能を獲得する。Xenopus laevis(X.laevis)の近縁種でありゲノムの倍数性が2倍体(2n=20)であるXenopus tropicalis(X.tropicalis)において生殖細胞系譜の可視化ができれば、これらの生殖細胞分化機構の解明につながる。

　第1章では生殖細胞系譜について、X. tropicalisのpPGCを特異的に可視化する事を目的とした。しかしながら、X.tropicalisにおける生殖細胞系譜の発生様式は遺伝子発現も含めほぼ未知であったため、近縁種であるX.laevisの生殖細胞質を含むpPGCに特異的に発現するDAZ遺伝子(Xdazl)に注目した。X. tropicalisにおけるDAZ遺伝子を探索するため、Xdazlの部分的DNA断片をプローブとし、X.tropicalis cDNA・ライブラリーをスクリーニングした結果、X.tropicalis DAZ-like gene(Xtdazl)の単離に成功した。全長配列の決定により、XtdazlはX. laevisのXdazlと比較するとアミノ酸レベルで75％、塩基レベルで61％の相同性があり、DAZ family特有のDAZ-motifとRNP(RNA-binding protein)-domainが存在する事がわかった。各発生段階におけるX. tropicalis胚からmRNAを抽出し、RT-PCRによりXtdazl mRNAの発現を調べた結果、受精卵、胞胚、原腸胚、神経胚、尾芽胚、初期幼生期において発現が確認できた。成体組織においては脳、心臓、肝臓、脾臓、小腸、膵臓、筋肉、腎臓には発現が見られず、生殖巣である精巣と卵巣にのみ発現が見られた。加えて、WISH(Whole-mount in situ hybridization)によりXtdazl mRNAの空間的発現を追跡した結果、X.laevisでの知見におけるpPGCの局在とXtdazl mRNAの発現は一致していた。具体的に述べると、Xtdazl mRNAはSt. I前卵黄蓄積期卵母細胞から発現しており、METRO(message transport organizer)領域から植物極に局在後、受精による卵割を経て胞胚腔へ発現が移行する。その後、Xtdazl mRNA発現細胞は神経胚形成期を通じて原腸直下に停滞しているが、尾芽胚期から初期幼生期に至るまでに背側腸間膜に移動する。これらの結果より、XtdazlはX. tropicalisのpPGCにおいて特異的に発現する遺伝子であると結論付けられるため、X. tropicalisの生殖細胞系譜を追跡する最初の遺伝子マーカーとなることを明らかにした。

　第2章では、XtdazlがX. tropicalisのpPGCに特異的に発現する事から、個体を生存させたままpPGCを可視化するために不可欠なXtdazlプロモーターを探索した。Xtdazlの部分的DNA断片をプローブとして、X.tropicalisゲノム・ライブラリーをスクリーニングした結果、Xtdazlの転写開始点を含む推定プロモーター領域(約5kbp)を得る事に成功した。Luciferase Assayによりプロモーター活性を確認後、この推定プロモーター領域にレポーター遺伝子(EGFP: enhanced green fluorescent protein)とmRNAの局在化に必要である事が判明したXtdazlの3'UTR(untranslated region)を組み込んだプラスミド(Xtdazl::EGFP-3'UTR)を構築した。pPGCを特異的に可視化する目的でXtdazl推定プロモーター領域の単離に成功し、更にXtdazl部位特異的エンハンサー領域の必要性に関する解析の一部が示された。

　なお、本論文の第1章は、高橋、種子島、小沼、原本、浅島らとの共同研究であるが、論文提出者が主体となって分析及び検証を行ったものである。第2章については論文提出者が全て主体的に行ったものである。それゆえ、本論文は論文提出者の寄与が十分であると判断する。

　したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。