新規p53標的遺伝子の単離および機能解析

　p53はヒト癌の約半数以上において突然変異が確認される癌抑制遺伝子で、p53蛋白質は種々のストレスに応答し標的遺伝子の活性化を遂行する転写活性化因子として生体内で機能している。生体が抗ガン剤、紫外線照射等のDNAダメージを受けた際、その損傷程度が軽微である場合は細胞周期を停止し、DNA修復を促進し、損傷が深刻で修復不可能な場合はダメージを受けた細胞をアポトーシスに誘導することで生体の恒常性を維持している。また、p53依存性アポトーシス関連遺伝子の誘導には、p53蛋白質の適切な翻訳後修飾が必要であることが報告されている。

　p53アデノウイルスベクターを用いた癌遺伝子治療において、p53遺伝子導入が必ずしも癌細胞にアポトーシスを誘導しない理由として、p53蛋白質の適切な翻訳後修飾の欠如があると考え、本研究ではp53遺伝子治療に代わる新たな遺伝子治療候補遺伝子の検索を目的とし、アポトーシスをより優位に誘導することが報告されている変異型p53(121F)を活用し、p53依存性アポトーシスに関与する遺伝子の単離とその機能解析を行った。p53蛋白質のアミノ酸残基121位SerをPheに置換した変異型p53(121F)が正常型p53(p53-wt)より優位にアポトーシスを誘導する背景にはp53依存性アポトーシスに関わる標的遺伝子が特異的に活性化されていると考え、cDNAマイクロアレイを用いて、p53-wtに比べ121Fによって強力に発現誘導された遺伝子を選別した。本研究では中でも発現誘導の著明であったSTAG1遺伝子の機能解析を行った。

　STAG1は外来性p53-wtによる発現誘導および外来性121Fによる発現誘導亢進を示すことがノザンおよびウェスタン解析により確認され、クロマチン免疫沈降法からSTAG1遺伝子のイントロン1に存在するp53結合部位に外来性p53-wtおよび外来性121Fが結合することが明らかとなった。また、アドリアマイシン、ガンマ線照射および紫外線照射によりSTAG1遺伝子が内在性p53依存性に発現誘導を受けることがノザン解析により明らかとなった。LS174T(p53+/+)にUV照射を行うと、STAG1蛋白質は発現上昇しアポトーシスが誘導されたが、siRNAによりこの発現を抑制したところ、アポトーシスは抑制された。また、STAG1遺伝子の強制発現によるcolony formation assayでは肺癌細胞株H1299，大腸癌細胞株HCT116，グリオーマ細胞株T98において顕著な増殖抑制作用を認め、アデノウイルスベクターを用いたSTAG1遺伝子導入は癌細胞株においてアポトーシスを誘導した。そこで8種の癌細胞株に対するアポトーシス誘導能を検討した結果、Ad-STAG1は3種の癌細胞株においてAd-p53wtより強力なアポトーシス誘導能を持つことが示された。以上の結果からSTAG1は121Fによって誘導されるp53標的遺伝子であり、p53依存性アポトーシスの新しい実行因子の一つである可能性が示されたと同時にAd-p53に代わる次世代型遺伝子治療候補遺伝子としての可能性が示された。

　本研究はp53遺伝子治療に代わる新たな遺伝子治療候補遺伝子の検索を目的とし、アポトーシスをより優位に誘導することが報告されている変異型p53-121Fを活用し、p53依存性アポトーシスに関与する遺伝子の単離とその機能解析を行ったものであり、以下の結果を得ている。

1.CDNAマイクロアレイ法を用いて、p53依存性アポトーシスに関与する遺伝子検索を試行した結果、STAG1遺伝子を同定した。外来性および内在性p53依存性のSTAG1転写発現誘導をノザン解析およびウェスタン解析により明らかにした。また、クロマチン免疫沈降法によりSTAG1遺伝子がp53標的遺伝子である可能性が示された。

2.野生型P53をもつ大腸癌細胞株LS174Tに対する種々のUV照射および付随するフローサイトメトリー解析、ウェスタン解析からSTAG1は細胞が重篤なDNAストレスを受けた際に発現誘導される可能性が示された。

3.一過性の強制発現によるコロニーフォーメーションアッセイの結果、外来性STAG1発現は細胞増殖に対して抑制的に作用することが示された。またアデノウイルスベクターを用いたSTAG1発現はTUNEL法によりアポトーシス誘導活性を有することが示された。また、RNAi法によるSTAG1発現抑制は外来性および内在性p53により誘導されるアポトーシス反応を減少させ、内在性STAG1が強制発現系同様にアポトーシス誘導に関与することが示された。

4.8種類の癌細胞株に対するアポトーシス誘導活性をフローサイトメトリーにより検討した結果、アデノウイルスベクターを用いたSTAG1発現は、p53発現よりも強力なアポトーシス誘導活性をもつ可能性が示された。

5.固形腫瘍においてSTAG1発現量が亢進している報告が散見されるが、本研究において作成した抗STAG1抗体によるウェスタン解析、既存の報告およびデータベースに登録されているSTAG1配列情報からSTAG1は細胞の種類や外界からの刺激の種類により転写調節機構が変化する可能性が示唆された。

　以上、本論文はcDNAマイクロアレイを用いた網羅的な手法により、P53より強力なアポトーシス誘導活性を有するSTAG1遺伝子を同定し、機能解析からP53による抗腫瘍メカニズムの解明、およびP53に代わる新たな遺伝子治療法の可能性を示唆した重要な意義をもつものと考えられ、学位の授与に値すると考える。