生体に備わっている自己防御機構は免疫系と呼ばれ、自己・非自己を認識し非自己を排除する極めて優れたシステムである。免疫系は自然免疫と獲得免疫に大きく分けられる。獲得免疫においては、T細胞やB細胞が主な役割を担っている。T細胞は表面にT細胞受容体（T cell receptor: TCR）と呼ばれる抗原受容体を発現しており、B細胞の抗原受容体である免疫グロブリンと同様V(D)J組み換えにより抗原認識多様性を生み出す。近年の研究からT細胞の十分かつ強力な活性化にはTCRからの第1シグナルに加えて、細胞表面上の補助シグナル分子を介したシグナル（第2シグナルあるいは補助シグナル）が必要であることが明らかにされてきた。現在までに補助シグナルを誘導する多くの分子が判明し、中でもCD28分子はT細胞上に恒常的に発現し、抗原提示細胞上のリガンドB7-1 (CD80)またはB7-2 (CD86)との相互作用によりT細胞に活性化シグナルを伝達することが知られている。そこで私は、T細胞上のCD28分子を選択的に機能阻害させ、T細胞の免疫応答を制御することを試みた。CD28分子を機能阻害する方法としては、近年開発されたFALI（Fluorophore-assisted light inactivation）法を用いた。FALI法とはFluorescein Isothiocyanate (FITC)蛍光色素を標識した特異抗体を標的分子に結合し、FITCの吸収波長の光を照射することで、一重項活性酸素が産生される。その時、標識抗体近傍半径40 Åに存在する標的分子の構造変化が惹起され、その正常機能を阻害する新規技術である。T細胞としては、ヒトTリンパ球性白血病株E6.1および末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cell: PBMCs)を用いた。

　まず、E6.1細胞をFITC標識抗CD28抗体と反応させ、FITCの吸収波長である488 nmの青色光を１時間照射してFALI法を行った後、抗CD3抗体・抗CD28抗体で細胞を刺激し、3.5時間後のIL-2のmRNA発現を検討した。FITC標識抗CD28抗体でFALIを行った細胞（以下CD28-FALI）では、FITC標識IgGをFALIに用いたコントロールと比較して著明なIL-2 mRNAの減少を認めた。青色光照射を行わなかったコントロール、抗体を含めなかったコントロールでは抑制が認められないことから、FALIの特異性が確認された。更にCD28非依存性に細胞を活性化するPHAで刺激した細胞においてはCD28-FALIの抑制効果が認められないことから、CD28-FALIがCD28を介した補助シグナルを特異的に抑制していることが示された。また、CD28-FALIのIL-2 mRNA発現量は定量的real time PCR法においても、CD28-FALIのIL-2 mRNA発現量は、FITC標識IgGをFALIに用いたコントロールと比較して、63%の有意な抑制効果(p<0.05)を認めた。

　次にCD28-FALIの効果を刺激開始後24時間後の培養上清中のIL-2濃度(ELISA法)で検討した。CD28-FALIでは、FITC標識IgGをFALIに用いたコントロールと比較して、培養上清中IL-2 濃度は60%の有意な減少(p<0.01)を認めた。この結果によりIL-2の蛋白レベルでもCD28-FALIの効果が確認された。

　次にCD28-FALIによるE6.1細胞におけるCD3抗原に対する影響をフローサイトメトリーにて検討した。その結果、CD3陽性細胞は、CD28- FALIを行った細胞では91%に対し、光照射しなかた細胞では91.2%とCD3陽性細胞の割合に差は認めなかった。CD28-FALI後に抗体刺激をする際用いた抗CD28抗体の抗原に対する影響を同様に検討した。その結果、CD28陽性細胞は、CD28- FALIを行った細胞では85%に対し、光照射しなかた細胞では89%とCD28陽性細胞の割合に差を認めなかった。

　次にCD28-FALIにおける至適光照射時間を検討するために488 nmの青色光照射時間を15分・30分に短縮し、CD28-FALIの効果を検討した。培養上清中IL-2濃度は、照射時間30分のCD28-FALI細胞で、FITC標識IgGをFALIに用いたコントロールと比較して、76%の有意な減少(p<0.01)を認めた。一方、照射時間15分では、CD28-FALIによる有意なIL-2産生の抑制(p<0.01)が認められたが、39%減少と抑制の程度が30分と比較し減弱していた。以上の結果から、30分の青色光照射で十分なFALI効果が認められることが示された。

　次に、CD28-FALIによるCD28抑制効果の持続時間を培養上清中のIL-2濃度で検討した。E6.1細胞に対しCD28-FALI後22時間培養後、抗CD3抗体・抗CD28抗体による刺激を行った。その結果、CD28-FALIを行った細胞のIL-2産生量はコントロールと比較し41%の減少傾向が認められたが有意差はなかった。この結果から、FALI施行後時間が経過すると、CD28-FALIの効果が減弱することが分かった。

　次に、より生理的な条件下でのCD28-FALI法の効果を検討するために、PBMCsにおいて同様の効果が得られるかを検討した。PBMCsの活性化には特異的抗原として破傷風毒素(TT)とHBs抗原(Hepatitis B Surface Antigen(HBsAg), Subtype adr, Recombinant)を用いた。過去に破傷風毒素またはB型肝炎ウイルスのワクチン接種を受け、免疫を獲得していると考えられる正常ボランティアより採取した血液よりPBMCsを調整し実験に使用した。CD28-FALIを行った後、TTにて刺激し48時間後の培養上清中のIL-2濃度を測定した。その結果、CD28-FALIを行った細胞ではFITC標識IgGを用いたコントロールと比較して、著明なIL-2産生抑制効果（86%減少）が認められた(P<0.01)。同様にCD28-FALIを施行した後、HBs抗原にて66時間刺激を行った後に培養上清中のIL-2濃度を測定したところ、CD28-FALIを行った細胞では、コントロールと比較し、有意なIL-2産生抑制効果（46%減少）が認められた(P<0.05)。以上のことから、特異抗原刺激に対するPBMCsのIL-2産生においても、CD28-FALIが有効であることが示された。

　CD28-FALIの補助シグナルの抑制効果が、FALIに伴う細胞死によるものでないことを確認するために、細胞死を定量的に解析できるMTT assay（細胞増殖アッセイ）を行った。CD28FALIを行った直後のE6.1細胞、PBMCs、CD28FALI後さらに24時間HBs抗原で刺激を行った後のPBMCsにおいて、MTT assayを行ったところ、いずれの条件下でも明らかな細胞死は認められなかった。

　FALI法はFITC標識した抗体を標的分子に結合させ、光を照射することで、時間的空間的に随時に随意に分子を機能阻害できる新たな分子の機能解析法である。現在、分子生物学で一般的な分子機能阻害の一つは相同組換えを利用した遺伝子欠損（ノックアウト）モデル動物であるが、その作成方法が煩雑で多くの時間を要すること、機能が代償されてしまう可能性のあること、生存に不可欠な分子の場合（胎生致死など）作成できないなどの問題点が存在する。一方FALI法は標的分子の結合抗体さえあれば非常に簡便に施行でき、時間的・空間的に随意な阻害が可能なため、胎生致死、他の分子の代償性発現上昇などの問題点を回避できる。今回の実験でもCD28-FALI法はノックアウト法と比較し、遜色の無くIL-2産生を抑制したと考えられた。

　その他の一般的な分子機能阻害法としては、中和抗体やドミナントネガティブ型変異体の過剰発現、アンチセンス法、RNAi法などが挙げられる。CD28に特有の機能阻害法としてはCTLA4Igが使用されることが多い。CTLA-4は抑制性補助シグナルを伝えるT細胞上の受容体であり、CD28とリガンドを共有しているが、リガンドとの親和性がCD28より非常に高く、B7/CD28を介した補助シグナルの阻害タンパクとしてin vitroやin vivoで応用されている。このような分子に特有の機能阻害法に対し、FALI法はどんな分子であっても結合する抗体さえあれば確実に分子を不活化できるため、応用範囲が広いという利点がある。また、アンチセンス法やRNAi法では、初代培養細胞など細胞によってはトランスフェクション効率が低い、また用いる塩基配列の設計が難しいなどの難点があるが、FALI法はどのような細胞にも応用可能である点が優れている。

　また、FALI法はノックアウト法やRNAi法などの分子機能阻害法と比較し、遺伝子導入を行わなくて良いため、臨床応用がしやすいという利点を持つ。アレルギー反応や自己免疫疾患などの過剰な免疫反応を抑制するために、末梢血より分離したPBMCsに対してCD28-FALIを施行し生体内に戻すといった免疫療法への臨床応用の可能性も考えられる。しかしながら、FALI法の生体への施行例はまだ報告がなく、FITC標識抗体の生体への影響や生体内でのFALI効果の持続など今後検討すべき課題である。

　以上、新しい分子機能阻害法であるFALI法を応用して主要な補助シグナル分子CD28の機能を阻害することによりT細胞の活性化を調節することが可能であることが示された。今後、本研究で確立した方法は、アレルギー疾患や自己免疫疾患、移植後拒絶反応などの免疫病に対する治療法へと応用できることが期待される。

Fluorophore-assisted light inactivation法(以下FALI法)はChromophore-assisted laser inactivation法(以下CALI法)を基に開発された新規分子機能阻害法である。CALI法はレーザー光を照射し分子機能阻害を行うため、レーザー光の照射野に阻害範囲が限られていたが、FALI法は非レーザー光源を使用するため、照射野が広く、一度に多くの検体を処理することが可能である。現在のところ免疫細胞にトランスイルミネーターを用いてFALI法を行い、細胞の活性化を検討した報告はない。本研究では、培養T細胞と末梢血単核細胞を用い、細胞表面上のCD28分子に対してFALI法を行い(CD28-FALI)、下記の結果を得た。

1.培養T細胞において、CD28-FALI後、抗CD3抗体と抗CD28抗体を用いて刺激したところ、IL-2の産生はmRNAレベルとタンパクレベルで抑制された。

2.培養T細胞において、CD28-FALIのCD3抗原への影響をフローサイトメトリーで検討した結果、影響しないことが分かった。

3.培養T細胞において、CD28-FALIの刺激に使用した抗CD28抗体の、抗原への影響をフローサイトメトリーで検討した結果、影響しないことが分かった。

4.培養T細胞にて、光の照射時間を60分から15分まで短縮したところ、本実験系では30分照射で十分なFALI効果が得られた。

5.培養T細胞にて、FALI後22時間でCD28-FALIの効果が減弱した。

6.ヒト末梢血単核細胞にて、CD28-FALIは特異抗原刺激(破傷風毒素、HBs抗原)に対するIL-2産生も抑制することが分かった。

7.培養T細胞とヒト末梢血単核細胞において、CD28-FALIは明らかな細胞障害性を認めなかった。

　以上、新しい分子機能阻害法であるFALI法を応用して主要な補助シグナル分子CD28の機能を阻害することによりT細胞の活性化を調節することが可能であることが示された。今後、本研究で確立した方法は、アレルギー疾患や自己免疫疾患、移植後拒絶反応などの免疫病に対する治療法へと応用できることが期待され、学位の授与に値すると考えられる。