[本研究の背景および目的]

　関節リウマチ(rheumatoid arthritis: RA)は、関節滑膜を病変の主座とする原因不明の慢性炎症性疾患である。RAの滑膜組織は炎症性細胞浸潤と滑膜線維芽細胞の増殖を特徴とする。炎症性細胞の浸潤は未知の自己抗原に感作されたT細胞が惹起すると考えられているが、炎症がいったん惹起された後は、マクロファージ系の炎症細胞の活性化が中心となりさまざまな炎症性サイトカインを産生する。産生された炎症性サイトカインに滑膜線維芽細胞が反応して過剰に増殖しその結果生じる増生滑膜組織はパンヌス組織となって、骨・軟骨を破壊する。

　現在、RAの治療の中心は疾患修飾性抗リウマチ薬(disease-modifying anti-rheumatic drugs: DMARD)とよばれる一連の薬剤であり、一定の有用性を認めるものの、効果発現まで数ヶ月以上かかること、種々の副作用の合併および有効性の予測が困難なこと、そしてその作用機序が十分に明らかにされていないことなどの問題がある。これに対し、病因となる分子を標的にした治療法の開発が行われつつある。すなわち炎症性サイトカインであるtumor necrosis factor-α(TNF-α)やinterleukin-1(IL-1)などがRAにおける関節破壊に関連する各種炎症性メディエーターの発現調節に重要であることが明らかにされ、それらのサイトカインを標的にした生物学的製剤が開発されその有効性が示されている。

　Nuclear factor-kappa B(NF-κB)はRAに関連する炎症性サイトカインの産生と機能を調節する重要な転写因子のひとつであり、RAの治療標的として注目されている。NF-κBはN末端側にRel homology domain(RHD)とよばれる構造を有するRel familyに属する転写因子であり、リンパ球、滑膜細胞を含む関節滑膜周囲のほとんどの細胞に存在し、無刺激時にはその阻害タンパクであるIκB(Inhibitor of κB)と複合体を形成して、細胞質にとどまっている。TNF-α、IL-1などの細胞外刺激によりリン酸化されたIκBはユビキチン化された後プロテアソームにより分解されるため、NF-κBはIκBから解離して核内へ移行し、炎症性サイトカイン、ケモカイン、接着因子などの標的遺伝子の転写を促進する。NF-κBの活性化に必須のIκBのリン酸化はIκB kinase(IKK)複合体により行われる。IKK複合体はキナーゼ活性をもつIKK-αとIKK-βの他、制御蛋白質であるIKKγの少なくとも3種類のサブユニットから構成されている。TNF-αやIL-1などの炎症性刺激によるNF-κBの活性化にはIKK-βが重要であることが明らかにされている。

　RAの治療に現在使用されている薬剤の中で、アスピリン、サリチル酸、金製剤、スルファサラジン、メトトレキサートがIKKを阻害することによりNF-κB活性を抑制すると報告されている。さらに、NF-κB阻害療法の有効性は関節炎モデルでも証明されている。このことから、NF-κBを標的とする治療法がRAの治療戦略として有力であると予想される。

　従来の創薬研究は、天然化合物あるいは合成化合物のライブラリーの中から、標的とする生体高分子の活性に影響を与える化合物をランダムスクリーニングする方法が一般的であったが、高速ランダムスクリーニング法を採用しても、時間と労力を要する効率性の問題があった。これに対し、創薬ターゲットの立体構造に基づき、コンピュータを用いて標的分子に作用する薬剤分子をデザインし、創薬の効率化、成功率の向上を目指す論理的分子設計法が試行されつつある。

　本研究では、コンピュータによる論理的分子設計に基づきIKK-β阻害薬として設計された化合物の一群からスクリーニングにより最有力候補薬剤としてIMD-0560を選択し、in vitroの系でRAの培養滑膜細胞の機能に及ぼす影響と、in vivoのマウスコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおける効果を評価し、新たな抗リウマチ薬としてのIMD-0560の役割を検討した。

[方法]

　コンピュータによる論理的分子設計に基づきIKK-β阻害薬として設計された15種類の薬剤から、in vitroでRA培養滑膜細胞でのサイトカイン産生を低濃度で抑制し、またマウス関節炎モデルにて関節炎を特に強く抑制する薬剤として新しい低分子化合物であるIMD-0560を選択した。

　IMD-0560の存在下で滑膜細胞をTNF-αにて刺激し、培養上清中に遊離される炎症性サイトカイン(IL-6、IL-8、MCP-1)の量をELISA法にて測定した。また、滑膜の増殖に与える影響をBrdUの取り込み抑制の程度により検討した。RA培養滑膜細胞のNF-κB活性に与えるIMD-0560の効果をGel shift assayにて評価した。また、RA培養滑膜細胞にてNF-κBの上流のキナーゼであるIKKの活性に与えるIMD-0560の影響をWestern blotting、In vitro kinase assayにて測定した。

　また、コラーゲン誘発性関節炎に与えるIMD-0560の効果を検討するために、オスのDBA/1Jマウスをcomplete Freund's adjuvantとともにbovine type II collagenで免疫し、3週後にincomplete Freund's adjuvantとbovine type II collagenで追加免疫し、コラーゲン誘発性関節炎を誘導した。IMD-0560を予防的に第一回免疫時より48時間おきに腹腔投与した。第二回免疫後、関節炎発症率、関節炎スコア(発赤、腫脹、変形)を測定し、病理学的検討を行った。

[結果]

　In vitroにおけるRA培養滑膜細胞での炎症性サイトカイン産生の優れた抑制効果により選択したIMD-0560は、IL-6、IL-8、MCP-1の産生を濃度依存的に抑制し、Gel shift assayの検討により濃度依存性にNF-κBのDNAへの結合を抑制し、NF-κB活性に対する直接的な効果を有することを確認した。

　IMD-0560のIκBの発現に対する影響を測定するWestern blottingの検討の結果、IMD-0560非存在下ではTNF-α刺激によりIκBαが10分以内に分解され、60分後に再び出現するのに対し、10μMのIMD-0560によりIκBαの分解は完全に抑制された。また、免疫沈降したIKK複合体を用いたIn vitro kinase assayでは、IMD-0560処理により濃度依存性にGST-IκBαのリン酸化が抑制され、滑膜細胞のIKK活性が低下した。Reporter gene assayの結果IMD-0560がIC50として0.25μM以下の低濃度でIKK-β活性を抑制することを認めた。IMD-0560はRA滑膜細胞の増殖を濃度依存的に抑制した。また、細胞周期解析では、滑膜細胞の増殖はG0/G1期からS期への進行が抑制されていることが判明した。

　マウスコラーゲン誘発性関節炎に与える影響をみると、IMD-0560は関節炎の発症率、関節炎の重症度ともに濃度依存性に抑制し、膝関節の病理学的検討より得られた病理スコアと関節炎スコアは有意な相関があり、IMD-0560投与群では病理学的にも有意な改善を認めた。

[考察]

　本研究では、コンピュータによる分子設計によりIKK-βのATP結合部位に競合阻害しうる化合物の中から選択された低分子化合物IMD-0560が、RAの治療薬としての可能性があるかどうかを検討した。

　滑膜細胞ではTNF-α刺激により亢進しているIL-6、IL-8、MCP-1の産生がIMD-0560投与により濃度依存性に抑制され、IC50は10μM未満であることが確認された。RA滑膜細胞におけるTNF-αからNF-κBへのシグナル伝達経路への影響については、IMD-0560が滑膜細胞におけるNF-κBのDNA結合活性を抑制することが示された。すなわちIMD-0560のサイトカイン産生抑制の効果は、NF-κBの活性を直接抑制する機序によることが示唆された。

　IκBαのリン酸化とそれに続く分解がNF-κBの核内への移行に必須であり、IκBαのリン酸化はIKKによって制御されていることが報告されている。TNF-α刺激による細胞内IKK活性とIκBαの分解は10μMのIMD-0560によって完全にブロックされた。このことからIMD-0560の効果はTNF-αからIKKへのシグナル伝達経路を標的としていることが示唆された。

　IKK-β阻害薬として創薬されたIMD-0560は、IKK-βからNF-κBのシグナル伝達経路を低濃度で抑制していたが、キナーゼプロファイリングではMAP kinase系のシグナル伝達経路も10μMのIMD-0560により50%以上抑制されることが判明した。したがって、IMD-0560はIKK-βに特異的に作用する薬剤ではなく、MAP kinase系やさらに上流にある他のキナーゼなどを抑制している可能性も考えられた。

　In vivoのマウスコラーゲン誘発性関節炎モデルの系において、IMD-0560が濃度依存性に関節炎発症率、重症度ともに改善したことから、抗リウマチ薬として有効である可能性が示唆された。

[結語]

　本研究では、IMD-0560がRA滑膜細胞においてNF-κBのシグナル伝達経路を抑制することが確認された。IMD-0560のRAに対する治療効果が期待できる機序としてIKK-βの抑制が関与していると考えられた。またIMD-0560はコラーゲン誘発性関節炎に対して非常に有効であり、臨床的有効性が示唆された。IMD-0560が選択的なIKK-β阻害剤ではないことが判明したが、IKK-βの結晶構造が解明されれば、論理的分子設計による創薬技術により、より特異的で強力な阻害剤の開発が可能になると考える。以上より、RAの新しい治療薬の開発に論理的分子設計による創薬が今後一層期待できると考える。

　本研究はコンピュータによる論理的分子設計により開発された新規Nuclear factor-kappa B(NF-κB)阻害剤、IMD-0560について、in vitroの系でRA培養滑膜細胞の機能に及ぼす影響と、in vivoの系でマウスコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおける効果を評価し、新たな抗リウマチ薬としての役割を検討したものであり、下記の結果を得ている。

1.IMD-0560は、RA培養滑膜細胞からのIL-6、IL-8、MCP-1の産生を濃度依存的に抑制し、Gel shift assayの検討により濃度依存性にNF-κBのDNAへの結合を抑制し、NF-κB活性に対する直接的な効果を有することを確認した。

2.IMD-0560のIκBの発現に対する影響を測定するWestern blottingの検討の結果、10μMのIMD-0560によりIκBαの分解は完全に抑制された。また、免疫沈降したIKK複合体を用いたIn vitro kinase assayでは、IMD-0560処理により濃度依存性にGST-IκBαのリン酸化が抑制され、滑膜細胞のIKK活性が低下した。Reporter gene assayの結果IMD-0560がIC50として0.25μM以下の低濃度でIKK-β活性を抑制することを認めた。

3.IMD-0560はRA滑膜細胞の増殖を濃度依存的に抑制した。また、細胞周期解析では、滑膜細胞の増殖はG0/G1期からS期への進行が抑制されていることが判明した。

4.マウスコラーゲン誘発性関節炎に与える影響についての検討では、IMD-0560は関節炎の発症率、関節炎の重症度ともに濃度依存性に抑制し、膝関節の病理学的検討より得られた病理スコアと関節炎スコアは有意な相関があり、IMD-0560投与群で病理学的にも有意な改善を認めた。

　以上、本論文は、コンピュータによる論理的分子設計により開発された新規Nuclear factor-kappa B(NF-κB)阻害剤、IMD-0560が、RA滑膜細胞においてIKK-βからNF-κBのシグナル伝達経路を抑制することを確認し、コラーゲン誘発性関節炎に対して非常に有効であることを明らかにした。また、論理的分子設計による薬剤の開発が今後臨床応用の期待できる方法としてより一層期待できるものであることを確認した。本研究は、関節リウマチの新たな治療の一つとして重要な貢献がある有用な研究と考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。