細胞質分裂(サイトキネシス)は低分子量GTP結合タンパク質やタンパク質のリン酸化などにより厳密に調節されている。低分子量GTP結合タンパク質の中でもRhoAは特に注目されており、C3 exoenzymeでRhoAを不活性化しても、恒常的活性化型RhoAを細胞に導入しても細胞質分裂は阻害される。このことは、RhoAの活性化型、不活性化型のサイクルが重要であることを意味している。一方、低分子量GTP結合タンパク質の調節因子としてGDP-GTP交換因子 (Guanine nucleotide exchange factor, GEF) および加水分解酵素活性化因子 (GTPase activating protein, GAP) が存在し、細胞質分裂時のRhoAの活性もこれらの因子により巧妙に調節されていると考えられる。GEFの一つであるECT2は、細胞質分裂時に中央体においてRhoAと共局在し、RhoAを強く活性化する。しかし、逆にRhoAを不活性化するメカニズムは明らかになっていなかった。セリンスレオニン型のキナーゼであるAurora Bも、細胞質分裂時に中央体に局在することが知られており、変異体を用いた解析から細胞質分裂に関与していることが明らかになっていたが、その分子メカニズムは不明であった。

　マウス白血病細胞株であるM1細胞は、インターロイキン6刺激によりマクロファージ様細胞に分化する細胞である。MgcRacGAPは、この細胞にアンチセンスで発現させたときにインターロイキン6による分化誘導に抵抗性を示すことを指標に、当研究室においてクローニングされた。また、ヒト白血病細胞株であるHL60細胞にセンスで発現すると、マクロファージ様細胞への分化が観察された。その後の解析から、MgcRacGAPは間期にはおもに核内、細胞質分裂時には中央体に局在すること、および、GAP活性を持たないMgcRacGAPの変異体を細胞に導入すると、細胞質分裂が阻害され、多核化してしまう等の結果より、この分子のGAP活性が細胞質分裂に必須であることが明らかとなった。哺乳類の細胞において、中央体に局在することが知られているGAPはMgcRacGAPだけであるが、大腸菌で精製したMgcRacGAPは、RhoファミリーのメンバーであるRac1, Cdc42に対しては活性を持つが、RhoAに対しては活性を持たず、細胞質分裂時のRhoA不活性化の機構は不明であった。

　RhoA不活性化の機構を考えるうえで、MgcRacGAPにRhoGAP活性がある方が理解しやすい。しかし、大腸菌で精製したMgcRacGAPはRhoGAP活性を持たない。そこで、MgcRacGAPは中央体において何らかの修飾を受け、それによりRhoAに対するGAP活性が誘導されるのではないかと考えた。ヒト子宮頚部癌細胞株であるHeLa細胞から中央体を精製し、ウェスタンブロットしたところ、通常のMgcRacGAPの分子量より高い位置にバンドが検出され、脱リン酸化酵素を作用させると通常の位置に戻った。また、細胞培養液中に放射性のリンを加えて培養し、中央体のMgcRacGAPを免疫沈降したところ、放射活性のあるMgcRacGAPが検出されたため、リン酸化によりバンドがシフトしていることが明らかとなった。

　MgcRacGAPが中央体においてリン酸化されていることから、中央体に局在することが知られているAurora Bに注目した。まず手始めに、Aurora BとMgcRacGAPが複合体を形成するかをHeLa細胞を用いた免疫沈降法で調べた。同期したHeLa細胞では、細胞質分裂を行っている細胞が最も多くなるときに一致して、Aurora BとMgcRacGAPは複合体を形成した。また、精製タンパク質同士も結合することから、この2者の結合は直接的であることが示された。さらに、免疫染色法を用いて調べたところ、細胞質分裂の最終段階で2者の共局在が観察された。

　Aurora BとMgcRacGAPが直接結合することは明らかになったが、では実際にAurora BがMgcRacGAPをリン酸化するのかどうかの解析を行った。試験管内で、放射性リンの取り込み実験を行うと、確かにAurora BはMgcRacGAPをリン酸化していた。MgcRacGAPはおもに4つの領域からなっており、そのうちの3つの領域がAurora Bによりリン酸化を受けていた。GAP活性をもつ領域( GAP領域)もリン酸化されており、このことから、リン酸化によりGAP活性に何らかの変化があるのではないかと考えた。そこで、試験管内でAurora Bによりリン酸化を受けたGAP領域と、リン酸化を受けていないGAP領域でRhoAに対する活性を測定した。すると、リン酸化によりRhoAに対するGAP活性が認められた。

　リン酸化アミノ酸解析により、Aurora Bによりリン酸化を受けるのはほぼセリン残基のみであることが明らかとなった。GAP領域には7カ所セリン残基があるが、どのセリン残基がリン酸化されているかを試験管内で調べたところ、387番目(S387)と410番目(S410)のリン酸化が認められた。次に、この2カ所のセリン残基を、リン酸化セリンを模倣するアスパラギン酸残基に置換した変異体をそれぞれ(S387D, S410D)作製し、GAP活性を測定すると、S410Dでは野生型と変わらないのに対し、S387DにおいてはRhoAに対するGAP活性が認められた。しかし、逆にRac1, Cdc42に対するGAP活性は完全に消失していた。

　次に、S387に注目し、このセリンのリン酸化を特異的に認識する抗リン酸化抗体を作製した。この抗体でHeLa細胞を免疫染色したところ、中央体において強い染色像が確認された。リン酸化能を失ったAurora Bの不活性化型変異体を細胞に導入し、この抗体を用いて免疫染色した結果、中央体での染色は観察されなかった。よって、MgcRacGAPの中央体におけるS387のリン酸化において中心的な役割を果たすのはAurora Bであると考えられる。また、MgcRacGAPとRhoA, Rac1, Cdc42の細胞分裂時における共局在を調べたところ、分裂中期および後期ではRac1との共局在が観察された。細胞質分裂時においては、RhoAと中央体においてリング状の構造をとり、おそらく収縮環上で共局在していることが確認されたが、Rac1, Cdc42との局在は異なっていた。これらの結果より、中央体においてAurora Bによりリン酸化を受けたMgcRacGAPがRhoAに対するGAPとなるということが、試験管内でも、生体内においても確からしいと考えられた。

　最後に、S387にリン酸化を受けないようアラニン残基に置換した変異体S387Aを細胞に導入したところ、著明な細胞質分裂の阻害が観察された。一方、S387Dでは細胞質分裂阻害は確認できなかった。このことは、S387がリン酸化されること、つまりMgcRacGAPがRhoAに対するGAP活性を持つことが、細胞質分裂に必須であることを強く示唆している。

　本研究は細胞分裂の最終過程である細胞質分裂の機構を、低分子量GTP結合タンパク質およびその調節因子に注目し解析を行ったものである。細胞質分裂の終了には、低分子量GTP結合タンパク質であるRhoAの活性化型および不活性化型間のサイクルが重要であることが知られている。このサイクルの機構について、加水分解酵素活性化因子 (GTPase activating protein, GAP)であるMgcRacGAPに注目し解析を行い、以下の結果を得ている。

1.GAPタンパク質であるMgcRacGAPは、細胞質分裂に必須であること、細胞質分裂時に中央体に局在することが知られている。ヒト子宮頸癌の細胞株であるHeLa細胞を用いて中央体に局在するMgcRacGAPを精製したところ、翻訳後修飾を受けることが示され、さらに脱リン酸化酵素処理およびバイオラベル法を用いた解析からこの翻訳後修飾がリン酸化であることが示された。

2.MgcRacGAPのリン酸化を引き起こすリン酸化酵素の候補として、MgcRacGAP同様、細胞質分裂時に中央体に局在し細胞質分裂に必須であるAuroraBに着目した。HeLa細胞の細胞周期を同調し共免疫沈降法を用いて解析した結果、細胞質分裂時にMgcRacGAPとAuroraBが複合体を形成することが示された。さらに、免疫染色法によりこれら二者が中央体にて共局在することも示された。次に、AuroraBがMgcRacGAPをリン酸化するのかどうかを解析するため、試験管内で、放射性リンの取り込み実験を行ったところ、Aurora BはMgcRacGAPをリン酸化することが示された。MgcRacGAPはおもに4つの領域から構成されており、これらの領域を別々に解析した結果、3つの領域がAurora Bによりリン酸化を受けていた。GAP活性をもつ領域( GAP領域)もリン酸化されていることが示された。

3.大腸菌で発現、精製したヒトMgcRacGAPは低分子量GTP結合タンパク質であるRac１やcdc42に対してはGAP活性を発揮するが、RhoAに対してはGAPを示さないことが知られていた。そこで、このリン酸化がMgcRacGAPのRhoAに対するGAP活性に何らかの変化を及ぼすのではないかと仮説を立て、試験管内でAurora Bによりリン酸化を受けたGAP領域と、リン酸化を受けていないGAP領域でRhoAに対する活性を測定した。その結果、AuroraBによりリン酸化されたGAP領域はRhoAに対するGAP活性を示すことが明らかとなった。

4.リン酸化アミノ酸解析により、Aurora Bによりリン酸化を受けるのはほぼセリン残基のみであることが明らかとなった。GAP領域には7カ所セリン残基があるが、どのセリン残基がリン酸化されているかを試験管内で検討した結果、387番目(S387)と410番目(S410)のリン酸化が認められた。次に、この2カ所のセリン残基を、リン酸化セリンを模倣するアスパラギン酸残基に置換した変異体をそれぞれ(S387D, S410D)作製しGAP活性を測定したところ、S410Dでは野生型と変わらないのに対しS387DにおいてはRhoAに対するGAP活性が認められた。しかし、逆にRac1, Cdc42に対するGAP活性は完全に消失していた。

5.MgcRacGAPとRhoA, Rac1およびCdc42の細胞質分裂時における共局在を調べたところ、MgcRacGAPは細胞質分裂時においてRhoAと中央体においてリング状の構造をとり、おそらく収縮環上で共局在していることが確認されたが、Rac1およびCdc42との局在は異なっていた。

6.S387のリン酸化を特異的に認識する抗リン酸化抗体を作製した。この抗体を用いてHeLa細胞を免疫染色したところ、中央体において染色像が確認された。この結果より、S387は細胞内でもリン酸化されること、およびそのリン酸化が中央体にて引き起こされることが明らかとなった。また、リン酸化能を失ったAurora Bの不活性化型変異体をHeLa細胞に導入し、S387の抗リン酸化抗体を用いて免疫染色した結果、中央体での染色は観察されなかった。よって、MgcRacGAPの中央体におけるS387のリン酸化において中心的な役割を果たすのはAurora Bであると考えられた。

7.最後に、S387にリン酸化を受けないようアラニン残基に置換した変異体S387Aを細胞に導入したところ、著明な細胞質分裂の阻害が観察された。一方、S387Dでは細胞質分裂阻害は確認できなかった。このことは、S387がリン酸化されること、つまりMgcRacGAPがRhoAに対するGAP活性を持つことが、細胞質分裂に必須であることを強く示唆している。

　以上、本論文はヒト子宮頸癌細胞株であるHeLa細胞の細胞質分裂機構において必須な役割を果たすRhoA, MgcRacGAPおよびAuroraBの関係を明らかにした。本研究は生命の基本的現象である細胞分裂の機構の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。