The phagocyte NADPH oxidase is a multicomponent enzyme, indispensable for innate immunity as it produces reactive oxygen species （ROS） against invading pathogens （Fig.1）. Substrate of the enzyme is the NADPH. It provides the electrons for the reduction of O2 into O2-, which is rapidly transformed to ROS. The NADPH binding site on NADPH oxidase remains elusive.

NADPH oxidase consists of cytosolic（p47phox, p40phox, p67phox, and small GTPase Rac1 or Rac2） and membrane-integrated components（gp91phox, p22phox）. In resting cells the components are separated between cytosol and membrane. Upon activation, the cytosolic components are recruited to membrane and interact with the membrane-integrated components to form a functional complex. The p47phox PX domain plays a pivotal role in this recruitment process.

PX domain is a functional module that targets membranes through specific interaction with phosphoinositides. The p47phox PX domain preferably binds PI（3,4）P2. In activated phagocytes, the appearance of PI（3,4）P2 on the membrane coupled with a conformational change of p47phox that unmasks its PX domain, signals the translocation of p47phox towards the membrane.

I report here 1） a novel approach for the in vitro study of membrane-interacting proteins based on Transferred Cross Saturation（TCS）method and the use of liposomes as membrane mimic environment,2） the identification of the membrane embedded PI（3,4）P2 interacting interface on p47phox PX domain by a combination of TCS and Paramagnetic Relaxation Enhancement （PRE） experiment, and 3） evidence that p47phox PX the formation of NADPH binding site on the complex.

Results and discussion Under physiological conditions, phosphoinositides interact with effector proteins in the context of lipid bilayers and therefore the consideration of membrane-mimicking conditions for the in vitro study of these systems is of utmost importance. Liposomes represent the best model for biomembranes. However, their huge size hampers NMR analysis.

TCS is a novel NMR technique developed in our laboratory. It elegantly allows the amino-acid resolution power of NMR analysis to be employed for the study of protein-involved interacting systems with very large total size. The application of TCS method in the case of a protein interacting with membrane-embedded phosphoinositide is outlined in Fig.2 （upper panel）.

The membrane embedded C16-PI（3,4）P2 interacting interface on p47phox PX domain revealed by TCS experiment.

In order to identify the membrane interacting interface on p47phox PX domain for the membrane embedded PI（3,4）P2, TCS experiment was conducted. Uniformly labeled 2H, 15N p47phox PX was interacted with LUV （large unilamellar vesicles） with an average diameter of 100 nm and composition of POPC : POPE : PI（3,4）P2=79.5 : 20 : 0.5. Vesicles were prepared by extrusion. The experiment was conducted in 2H-MES, 2H-DTT, 90%D2O, pH 5.5 at 25oC under the mode of simultaneous saturation of the protons in the lipid tails and polar headgroups of liposome components. Selective saturation of liposome components led to intensity reduction for specific signals on the HSQC spectrum of p47phox PX. E49, F58, and I71 showed strong （RI>0.3）, M27,Y48, K55, M57, and G63 showed moderate （0.3>RI>0.25） while H8, E15, E56, N69, and I72 displayed weak intensity reduction （0.25>RI>0.2）. Mapping of these signals on the surface of the crystal structure of p47phox PX revealed the area that contacts the C16-PI（3,4）P2 containing liposomes （Fig.2 upper panel）. In an identical experiment using control liposomes （liposomes without PI（3,4）P2） none of the signals on the surface of p47phox PX displayed intensity reduction. The binding pocket of PI（3,4）P2 headgroup on p47phox PX domain revealed by Mn2+-induced PRE experiment In order to determine the binding site of PI（3,4）P2 polar head within the membrane embedded C16-PI（3,4）P2 interacting interface, we designed an experiment based on the PRE effect of Mn2+ adsorbed in the soluble analogue C4-PI（3,4）P2. Uniformly labeled 15N-p47phox PX domain was interacted with C4-PI（3,4）P2 in 5mM MES, 5mM DTT, pH 6.4 in the presence of 0.5 mM MnCl2. The HSQC spectrum of PX domain in its bound state with C4-PI（3,4）P2 revealed Mn2+-induced PRE effect for specific signals of the protein. Their mapping on the surface of the crystal structure of p47phox PX is shown in Fig 2 （lower panel）. Because of the distance-dependence mode of Mn2+ derived PRE, residues with 100% intensity reduction, namely T53, K55, E56 on one side and G63, A64, and I65 on the other side should form the walls of the PI（3,4）P2 binding pocket. Altogether, the above data suggest that the PI（3,4）P2 interacts with p47phoxPX in an area different from that already reported as PI（3,4）P2 binding site. It overlaps well with the site where one of the two bound sulphates were detected in the crystal structure of the protein and it is very close to the proline rich area that is responsible for the masking of PX domain in the close conformation of p47phox.

p47phoxPX domain interacts with NADPH with a Kd similar to that reported for the fully assembled NADPH oxidase complex

Upon addition of NADPH, specific signals on the HSQC spectrum of 15N-p47phox PX showed chemical shift perturbation. Mapping of these signals on the crystal structure of the protein is shown in Fig.3.

Residues with strong, moderate and weak normalized chemical shift change are colored red, orange and yellow respectively. Based on a NMR titration analysis, Kd for the interaction of NADPH with PX domain was estimated to be 69.1 uM. The reported Kd for the binding of NADPH on the NADPH oxidase complex is 60 uM.

Conclusions

In the present work, the membrane-embedded C16-PI（3,4）P2 interacting interface on p47phox PX domain was successfully determined by a combination of TCS and PRE experiment using liposomes as membrane-mimicking environment. This is in contrast to conventional approaches where the presence of membrane is either ignored （use of soluble analogues of ligands） or reproduced by using micelles. The NMR method proposed here should be of great utility for the study of phosphoinositide-effector modules like PX, PH, ENTH, and C2 domain.

In addition, the interaction of p47phox PX domain with the substrate NADPH, suggest that PX domain might play a dual role: it contributes to migration of the cytosolic components during assembly of NADPH oxidase and in a subsequent stage, it participates in the formation of NADPH binding site on the enzymic complex.

Fig.1: Activation of phagocyte NADPH　oxidase.

Fig.2: upper panel: （left） Application of TCS method to a liposome system. Selective RF pulse saturates the protons in the lipid components of the liposomes, without affecting the uniformly deuterated protein. The saturation is cross-transferred to the protein in the bound state, and in the case of fast exchange it is 'carried over'to the free state. Saturation is recorded as the intensity loss of cross-peaks on the HSQC spectrum of the free protein, exclusively shown by amide protons within the interacting interface.（right）Results of TCS experiment. lower panel: （left） PRE experiment based on the formation of [Mn−PI（3,4）P2] complex.（right）Results of PRE experiment.

Fig.3: Chemical shift perturbation on p47phox PX domain caused by NADPH.

食細胞NADPHオキシダーゼの活性制御におけるp47phox PXドメインの機能に関するNMR解析と題する本論文は、新規NMR測定法である転移交差飽和法ならびに常磁性緩和増大効果を利用して、p47phox PXドメインのリガンド認識メカニズムを明らかにした研究成果について記したものである。全体は主に3つの内容から成っており、第1は、転移交差飽和法を用いたp47phox PXドメインにおける、ホスファチジルイノシトール3、4リン酸（PI （3,4） P2）を含むリポソームとの結合面の同定、第2は、マンガンイオンによる常磁性緩和増大効果を利用したPI （3,4） P2極性頭部認識部位の決定、第3は、NADPHオキシダーゼのリガンドであるNADPHが、p47phox PXドメインに結合することをNMRに基づいて明らかにした、以上から構成されている。

第1章のイントロダクション、第2章の実験項につづき、第3章では、p47phox PXドメインの発現・精製とNMRシグナルの帰属について述べ、主鎖アミドシグナルを三重共鳴法とアミノ酸選択的ラベル法により完全に帰属している。第4章では、p47phox PXドメインが可溶性PI （3,4） P2と特異的に結合することを示し、解離定数を求めている。

第5章前半では、p47phox PXドメインのリガンド含有リポソーム結合部位を決定するために転移交差飽和法を適用している。転移交差飽和法は、複合体形成時に受けた飽和を遊離状態にて観測するため、原理的には複合体の分子量に制限を受けることなく結合界面を決定できる。本研究で行われたp47phoxPXドメインとPI （3,4） P2含有リポソーム複合体に対する転移交差飽和実験の結果は、この手法がリポソームのような巨大かつ大きさの不均一な生体物質に対して適用可能であることを実証するものである。

第5章後半においては、マンガンイオンによる常磁性緩和増大効果を利用して、p47phox PXドメインのPI （3,4） P2極性頭部認識部位を決定している。イノシトール環の隣接する水酸基がリン酸化されると2価金属を配位することに着目し、PI （3,4） P2がマンガンイオンと結合することをNMRに基づいて明らかにした。次に、p47phox PXドメインがPI （3,4） P2━マンガンイオン複合体に結合することを示し、マンガンイオンの常磁性緩和増大効果により、近傍のNMRシグナルが広幅化することを利用して、47phox PXドメイン上のPI （3,4） P2結合部位を同定した。

2つの異なるNMR手法によって示された結合部位は良く重なっており、結果が妥当であることを裏付けている。また、リガンド含有リポソーム結合面とリガンド極性頭部認識部位を比較することにより、脂質二重膜認識残基を示している。このような手法の組み合わせは、脂質認識タンパク質の構造生物学的研究に広く適用可能と考えられる。また、従来用いられているミセル滴定実験による脂質二重膜同定法と比較し、後者がミセル濃度によって結果が大きく変化し、本論文で提示した結果と一致しないことを示している。

p47phox PXドメインについて、点変異法と表面プラズモン共鳴法により、PI （3,4） P2結合部位が以前の報告にて提案されており、他のPXドメインのリガンド認識部位と同一と考えられていたが、本研究で示された結合部位は全く異なる部位であった。PXドメインは、共通したフォールドを持ち、共通の骨格をもつリガンドを認識するにもかかわらず、リガンド認識部位は全く異なる場合があることを本研究は明らかにしている。

第6章においては、活性酸素の発生装置であるNADPHオキシダーゼのリガンドであるNADPHが、p47phox PXドメインに結合することをNMRに基づいて示している。まず、NADPHが、本論文で明らかにしたPI （3,4） P2結合部位に結合することを示し、次に認識部位がアデノシン部位であることを示した。また、PI （3,4） P2とNADPHの結合が競合的であり、生体内のNADPH濃度において、p47phox PXドメインの結合がPI （3,4） P2からNADPHへと十分に置換されうることを示している。従来、NADPHオキシダーゼのリガンド結合部位は、膜結合サブユニットであるgp91 phoxと考えられていたが、その結合は弱く、本研究の成果は、従来の説に新たな展開を開く可能性がある。

食細胞NADPHオキシダーゼは、生体防御において重要な役割を果たす一方で、自己免疫疾患など様々な炎症増悪に関与すると考えられており、その制御が可能になれば、抗炎症薬の開発につながることが期待される。p47phox PXドメインのリガンド認識機構を解明し、さらにNADPH結合についても明らかにした成果は、このような創薬への足がかりとしても重要である。また、本研究で示された構造生物学的手法は、様々な膜結合タンパク質に適用可能である。

以上、本研究の成果は、p47phox PXドメインのリガンド認識機構の解明とその制御ならびに、膜近傍における分子間相互作用の解析に大きく貢献するものであり、これを行った学位申請者は博士（薬学）の学位を得るにふさわしいと判断した。