Dihydroorotate dehydrogenase （DHOD） catalyzes the oxidation of dihydroorotate to orotate, the fourth step and the only redox reaction in the de novo biosynthesis of pyrimidine. In addition of DHOD activity （first-half reaction）, the Trypanosoma cruzi DHOD （TcDHOD） has fumarate reductase （FRD） activity （second-half reaction） reducing fumarate produced in the mitochondrion and producing succinate that is excreted from the parasite （Fig 1）. It has been suggests that TcDHOD is involved not only in the de novo biosynthesis of pyrimidine but also in redox homeostasis of the parasite （Takashima, et al., 2002）.

Biochemical analysis indicates that TcDHOD functions as the main soluble fumarate reductase in the parasite （Takashima, et al., 2002） and TcDHOD knock down parasites could not survive even in the presence of exogenous pyrimidine bases and nucleotides （Annoura, et al., 2005）. It suggests that the Trypanosoma parasite is more dependent on fumarate reductase activity to maintain the redox homeostasis than the dihydroorotate dehydrogenase activity.

In this work, crystals of the TcDHOD in complex with orotate （product of its first-half reaction） and oxonate （a competitive inhibitor versus L-dihydroorotate） were obtained, and X-ray diffraction data were refined to final resolution of 1.80 and 1.12 A resolution, respectively. To clarify the enzyme reaction mechanism the crystals of TcDHOD in complex with dihydroorotate, fumarate, succinate and the native conformation were also obtained by soaking method and refined to 1.20, 1.50, 1.38 and 1.5 A resolution respectively. These high resolution crystal structures of the native TcDHOD and also in complex with its all physiological substrates and products, makes it possible to propose a molecular mechanism of first and second-half reaction for Family1A enzymes.

A mechanism of dihydroorotate oxidation had been proposed based on a computational docking model of the biding of L-dihydroorotate in the active site of Lactococcus lactis DHODA （Fig 2A）. In this model the carboxylate group of L-dihydroorotate is positioned close to the -SH group of Cys130 promoting its deprotonation, and the formed -S- abstract the proton from the C5 of dihydroorotate with cooperative hydride transfer to flavin isoalloxazine ring N5 （Rowland, et al., 1998）. However the detailed structural analysis of the obtained TcDHOD structure in complex with L-dihydroorotate （Fig 2B） indicates that the deprotonation of the Cys130 in the active site is not necessary to start the hydride transfer from L-dihydroorotate to flavin （Fig 3）.

Because there was no report about the molecular mechanism of fumarate reduction in Family1A DHODs, the TcDHOD was compared with the bacterial soluble （Shewanella frigidimarina and Shewanella putrefaciens） and membrane type （Wolinella succinogenes） FRDs. The fumarate binding domain is very conserved among these FRDs; however the mechanism of hydride transfer from flavin and the source of the second proton during the formation of succinate are different. In the membrane type FRD （Fig 4）, one of the two molecules of water stacking over fumarate in the active site is the second proton donor while for the soluble type FRD （Fig 5） is an arginine （Arg402）. In TcDHOD the second proton donor is the Cys130 （Fig 6） conserved among the Family1A and Family1B DHODs. The TcDHOD shows no sequence and structural similarity with those FRDs （Nara, et al., 2000）; however the twisted conformation of fumarate observed in all types of FRDs and also in TcDHOD should be important to facilitate the hydride transfer to fumarate. The TcDHOD has one molecule of water in the active site; however the role of this water is to stabilize the carbanion formed after the hydride transfer to fumarate （Fig 7）.

Fumarate reductases are not present in humans and TcDHOD shows very low sequence and structural similarity to human DHOD （23 %）. The structural analysis of TcDHOD with human DHOD indicates that there are differences in their active sites and in the molecular catalysis mechanism. These findings support that the bifunctional TcDHOD is a drug target for chemotherapy of Chagas' disease. Based in the structural data of TcDHOD obtained in this work, drug development by Structure Based Drug Design is now in progress with collaboration of Prof. Tanuma at Tokyo University of Science.

Figure1. Schematic illustration of dihydroorotate dehydrogenase of T.cruzi

Figure2. （A）A simple dpcking model of the binding of L-dihydroorotate in the activesite（Rowland,et al.,1998）.（B）The L-dihydroorotate complexed strucure obtained in this work.The distance between Cys130-SH group and the carboxyl group oxygens are shown in red dotted lines.

Figure3. First-half mechanism−TheL−dihydroorotate oxidation

Figure4. The Crystal structure of W.succinogenesFRD,PDB code,1E7P（A）showing the amino acids interacting with fumarate in the active site.（B）Its stereo view.

Figure5. The Crystal structure of S.frigidimarinaFRD,PDB code,1D4E（A）showing the amino acids interacting with fumarate in the active site.（B）Its stereo view.

Figure6. The side view of fumarate binding site of TcDHOD（A）showing that only the second carboxylate group of fumarate is twisted.Stereo view of fumarete interaction（B）.Dashed lines indicate the distance.Fumarate are colored in white and water in red.

Figure7. Second-half mechanism−The fumarate reduction

Figure8. Superimposition of crystal structure of human DHOD（pink） and TcDFOD（yellow）.

Trypanosoma cruzi （T. cruzi）によって引き起こされる寄生虫症であるシャーガス病は本研究を行った稲岡ダニエル健氏の母国ブラジルを含む多くの中南米の国々において、多数の死者を出し、また副作用のない特効薬が開発されていない事から、この地域の大きな問題となっている。そこで、新規の化学療法剤の開発が急務であるが、現在有望な薬剤は全くないと言って過言ではない。

ジヒドロオロト酸脱水素酵素（DHOD）はピリミジンde novo合成経路の第四番目の酵素であり、ジヒドロオロト酸をオロト酸に酸化する酵素である。ヒトのDHODはミトコンドリアの内膜に局在し、ジヒドロオロト酸の還元力をユビキノンに伝達する。この酵素に関しては、オロト酸およびユビキノンの拮抗阻害剤との共結晶が得られており、その解析からオロト酸とユビキノンがそれぞれ異なる部位に結合することが判っている。一方、T. cruziのジヒドロオロト酸脱水素酵素（TcDHOD）は可溶性タンパク質で細胞質に存在し、ジヒドロオロト酸脱水素酵素活性と共役したフマル酸還元活性を示し、フマル酸を最終電子受容体として用いている。すなわちピリミジン合成に加え、TCAサイクルで生じるフマル酸を還元することによって細胞質のredox バランスの維持に関わっている重要な酵素と考えられている。TcDHODはヒトのDHODと相同性が23％と低く、さらにTcDHODのノックダウンにより、トリパノソーマ原虫はピリミジン存在下でも増殖できないとの結果が得られている。これらのことからTcDHODはシャーガス病の化学療法剤開発のために極めて有望な標的と考えられる。そこで本研究では、シャーガス病に対する有効な薬剤の開発を最終目的とし、構造に基づいた薬剤の分子設計のための基本的情報を得るためにTcDHODを結晶化し、立体構造の解析を行った。

研究の第1段階として、結晶化実験に必要な大量の試料調製のため、TcDHODを大腸菌内で大量発現し高純度の組み換え酵素の精製法を確立した。続いて結晶化とその最適化の条件を検討した結果、第一反応生成物であるオロト酸と第一反応基質の拮抗阻害剤であるオキソン酸の複合体結晶を共結晶化法で得ることができた。それぞれのX−線回折データーは1.80と1.12 Aと高い解像度を示した。さらに酵素反応メカニズムを明らかにするためソーキング法を用いて種々の共結晶を試み、酵素のみの結晶、ジヒドロオロト酸、フマル酸およびコハク酸との複合体結晶を得る事が可能となった。その結果、それぞれ1.20、1.50、1.38と1.5 Aの解像度のX−線回折データーを得る事ができた。このように高分解能の生理的な全ての基質および生成物の複合体構造に基づいて、ジヒドロオロト酸がオロト酸に酸化される第一反応とその還元力を用いてフマル酸がコハク酸に還元される第二反応の反応機構について解析した。

第一反応におけるジヒドロオロト酸の酸化機構はLactococcus lactisのDHODAと反応生成物であるオロト酸複合体のドッキングモデルから考察されていた。すなわち、ジヒドロオロト酸のカルボキシル基によりCys130の-SHが脱プロトン化され、-S-がジヒドロオロト酸のピリミジン環のC5を脱プロトン化しC6のヒドリドがフラビンのN5に転移されると考えられていた。しかし、今回初めて得られたDHODと実際の基質であるジヒドロオロト酸複合体構造解析からは、これまで提唱されていたモデルと異なり、ジヒドロオロト酸のカルボキシル基はCys130の-SHを脱プロトン化出来る距離にはなく、ヒドリド転移にはC5は脱プロトン化される必要はないことが明らかとなった。

また、第二反応の基質であるフマル酸はジヒドロオロト酸と同じ部位に結合していたが、現在可溶性DHODのフマル酸還元反応の結合部位に関する情報がないため、嫌気性バクテリアが持つ可溶性（Shewanella frigidimarina およびShewanella putrefaciens）と膜結合型（Wolinella succinogenes）のフマル酸還元酵素（FRD）と比較した。フマル酸結合部位は可溶性と膜結合型FRDで保存されていたが、ヒドリド転移と二個目のプロトン源はそれぞれ異なっていた。膜結合型FRDではフマル酸の上下に水が一分子づつ存在し、どちらからも二個目のプロトンの供給が可能であり、可溶性型ではアルギニン（Arg402）が二個目のプロトン源であると考えられた。一方TcDHODはFRDとアミノ酸の相同性は低く、結晶構造解析の結果からもフマル酸の結合に関するアミノ酸は全く異なっており、二個目のプロトン源はCys130であった。しかし酵素に結合しているフマル酸の捩れたコンフォーメーションはFRDとTcDHODにおいて共通であった。これらのことからフマル酸の捩れたコンフォーメーションはヒドリド転移を容易にするために重要であると考えられた。また、TcDHODではフマル酸結合部位の周辺に水が一分子結合しているが、この水分子はフマル酸へヒドリド転移の後に生じるアニオンの安定化に関わっていると考えられた。

本研究で明らかになったように、ヒトはフマル酸還元酵素を持っておらず、またヒトDHODはTcDHODと相同性も低く構造も異なっていた。両者の構造を比較した結果、活性部位において基質と結合する異なる4個のアミノ酸が見つかり、さらに原子レベルでTcDHODとヒトDHODの第一および第二反応メカニズムの違いが明らかになった。これらのことからTcDHODはシャーガス病に対する新しい薬剤開発の有望な標的であることが明確になった。

今回得られた、アメリカ型トリパノソーマのDHODに関する新しい知見はフマル酸を最終産物とする1型DHODの反応機構の解明と新規抗トリパノソーマ薬の開発に大きく貢献するものであり、博士（薬学）の学位論文として十分な価値があるものと認められる。