序

ミトコンドリアや葉緑体は細胞内共生したバクテリアを起源としており分裂によってのみその数を増やすことが出来る。真核細胞が増殖する過程でこれらオルガネラの数が適切に維持されることや、オルガネラの分裂および形態変化が細胞分化や細胞死の重要なプロセスであることからオルガネラ分裂は細胞周期ネットワークの中に組み込まれていると予想されるがその分子的証拠はなく、またオルガネラ分裂装置の分子機構についての普遍的な知見も限られていた（総説1）。高等な生物では一細胞に何千ものミトコンドリアが存在し、活発に運動して頻繁に融合と分裂を行なっているので分裂という現象のみ純粋に扱うのは困難である。本研究で用いる単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（以下シゾンと略す）は細胞内に一つのミトコンドリアおよび葉緑体を持ち細胞分裂過程において順序良くそれらは分裂する。さらに明暗周期によって高度に細胞分裂を同調化できる。また全ゲノム配列が解読されていて、その冗長性が極小であり基本的なシステムとして解析しやすい（文献1）。修士課程において私はこのシゾンのミトコンドリア分裂においてFtsZとMDringとDynaminが協調的に働くことを明らかとし、基本的なモデルとして提唱したが（文献2）、それが葉緑体にも共通する普遍的なオルガネラ分裂機構であることが示された（文献3，4および図2）。

博士課程においては真核細胞がオルガネラ分裂を制御する基本システムを明らかとするため、（I）細胞骨格とミトコンドリアの空間的相互作用、（II、III）細胞周期によるミトコンドリアおよび葉緑体分裂の制御機構、（IV）オルガネラ分裂装置の単離精製と構成タンパク質の解析を行った。

結果と考察

シゾンにおける微小管構造とミトコンドリアの関係

一般にオルガネラの挙動は細胞骨格と密接な関係にある。シゾンの微小管とミトコンドリアを蛍光抗体法によって同時に観察すると微小管の極はミトコンドリアの両端に位置し、紡錘体の形成はミトコンドリア分裂の後に起こることがわかった（図3）。電子顕微鏡で観察すると紡錘体極はいわゆるSpindle Pole Body（SPB）に相当する二重の層からなる構造であり、その外層とミトコンドリア外膜が直接結合していた（図4）。従来は細胞骨格を軌道としたモータータンパク質を介する輸送がミトコンドリア分配の中心的機構とみなされていたが、今回見出された極との結合は染色体と共にミトコンドリアを分配する、より確実な機構と考えられる（文献5）。

細胞周期とミトコンドリア分裂の分子ネットワーク

Iよりミトコンドリア分裂は細胞周期の制御や微小管構築と連動している可能性が考えられた。そこで微小管重合阻害剤であるOryzalinで細胞を処理（以下Orzと略す）したところ、ミトコンドリアも葉緑体も分裂を完了した状態で細胞周期は停止していた（図5A、B）。これよりシゾンのミトコンドリアと葉緑体の分裂は微小管を必要としないことが分かる。さらに細胞核DNA の複製阻害剤であるCampthotecin で処理する（以下Cmp と略す）と細胞周期はS 期で止まると予想されるが、このとき葉緑体は異常に分裂を繰り返すのに対してミトコンドリアの分裂は抑えられていた（図5A,C,D）。これらのことから葉緑体分裂はS 期で促進され、M期で抑制されているのに対し、ミトコンドリア分裂はS期では抑制されて、M期で一度きり誘導されるといえる。ミトコンドリアにおいてDynamin（Dnm1）が最終段階に分裂面に集合して分裂を完了させることをすでに明らかとしているが（文献2,6）、このDnm1の局在と微小管を通常の細胞で同時に観察するとDnm1と微小管の先端とが接するように見られた（図6）この微小管とミトコンドリア分裂面との相互作用はミトコンドリア分裂が微小管形成および伸長に関与する、すなわち紡錘体形成のチェックポイント通過に関わる機構であるかもしれない。次に葉緑体とミトコンドリアの分裂に関わるFtsZとDynaminの細胞周期における増減をImmunoblotで解析した。葉緑体のFtsZ2とDynamin（Dnm2）、ミトコンドリアのFtsZ1は細胞分裂期に一過的上昇が見られたが、Dnm1には変動がなかった（図7）。そこでDnm1の細胞内局在を薬剤処理した細胞で解析するとCmpでは細胞質に分散している（図8A）のに対し、プロテアソーム阻害剤MG132処理（図8B）あるいはOrz（図8C）では細胞内に一つの輝点として存在した。MG132処理細胞はM期で停止していると予想されるがそのときミトコンドリアと葉緑体は分裂を終えていた。従ってDnm1がM期特異的に集合することでミトコンドリア分裂が完了することが示された（文献5）。

細胞周期と葉緑体分裂の分子ネットワーク

IIの結果から葉緑体分裂はS期特異的に誘導されていると考えられた。そこで薬剤処理下での葉緑体のFtsZ2とDnm2の蓄積量を解析した（図8B）。通常は双方とも分裂期に上昇し、その後α-tubulinより早い段階で消失する。OrzあるいはMG132処理下では通常とほぼ同様に消失するが、Cmpでは全く減少しないので双方ともS期に合成されM期に積極的に分解されていると考えられ、またその分解はプロテアソームに依存しないことも示唆された、さらに細胞質の翻訳阻害剤であるCycloheximide処理下（以下Cyhと略す）ではDnm2は消失するがFtsZ2はほとんど減少しなかった。CyhとCmp同時ではDnm2の消失が抑えられることから、CyhはM期におけるFtsZ2の分解のみ阻害することが分かった。Cyhの細胞を観察すると、通常の葉緑体分裂が終わったあと細胞分裂には至らず2つの葉緑体がさらに伸長していた（図9）。このときFtsZ2は両方の葉緑体中央に局在するが分裂は起こらない。以上のことから葉緑体分裂はFtsZ2とDnm2両方のS期における合成とM期における分解によって制御されていることが強く示唆され、さらに葉緑体内にあるFtsZ2のM期特異的分解が細胞質の翻訳阻害によって抑制されることから、細胞周期シグナルが葉緑体内に伝わる経路の存在が示された。

オルガネラ分裂装置の精製と構成タンパク質の同定

これまでに基本的なオルガネラ分裂機構としてFtsZ、PD/MDring、Dynaminの三つが主な要素であるとしてきたが、いまだPDringあるいはMDringの正体は不明である。そもそもミトコンドリアにおいては分裂装置の単離、精製というのは全く例がない。そこで私はシゾンの細胞周期を停止させることでミトコンドリア分裂のみ、あるいは葉緑体分裂のみを誘導するなかで特異的に増加するタンパク質を含む分画を生化学的に得ることを試みた。外側のPDringは界面活性剤や高塩濃度の処理に耐性であることがすでに示されていたので、あえてオルガネラの単離を経ずに直接細胞を破砕して処理して多段階の分別沈殿によって精製した（図10A）。得られた分画をSDS-PAGEおよびImmunoblotで比較するとOrz（M期停止）ではDnm1が、Cmp（S期停止）ではDnm2が主要なタンパク質として得られたことから、高度にオルガネラ分裂装置が精製されていることが裏付けられた（図10B）。これらDynaminのほかに100kDa付近にそれぞれ主要なバンドが得られたので、これらをTOF-Mass解析とゲノム情報から同定したところ、両方とも同一のタンパク質CMR185Cであった。その一次配列から予測されるドメインとしてはC 末端にWD40 repeat、中央にCoiled Coil領域があった（図11A）。いずれのドメインも多種多様なたんぱく質中に見出されるものであるため単純なホモロジー検索ではオーソログを見出すことは困難であるが、これら二つのドメインの配置は出芽酵母においてミトコンドリア分裂異常変異体から同定された遺伝子産物MDV1と相同である。酵母におけるMDV1の機能はDnm1をミトコンドリアに誘導する、あるいはDnm1の機能を発動する分子アダプターという解釈が与えられていたが、今回同定したCMR185Cの細胞内局在を解析するとミトコンドリア分裂初期からアーチ状の構造を形成し、やがて分裂予定面で閉じたリングとなった（図11B）。Dnm1との共局在性は後半にのみ顕著であること（図11C）から、CMR185Cは単なるDnm1の補助的役割を担うのではなくDnm1に先立って初期から分裂装置として中心的な役割を果たしていることが示唆された。

結論

紡錘体極がミトコンドリア両端に結合してミトコンドリア分配と染色体分配が同時に進行するという機構を見出し、ミトコンドリア分裂が紡錘体伸長のためのチェックポイント通過に関与する可能性を示した。

シゾンのミトコンドリア分裂はDnm1のM期特異的な集合によって完了するという、細胞周期とミトコンドリア分裂の分子ネットワークを初めて明らかとした。

葉緑体分裂においてはDnm2とFtsZ2はS期特異的に合成されて葉緑体を分裂させ、M期に入ると分解されるという、ミトコンドリアと相同な分裂装置に対して全く異なる制御機構が働いていることを示した。

オルガネラ分裂装置の単離精製系を構築してミトコンドリア分裂装置の単離に初めて成功した。その主要なタンパク質CMR185Cを同定し、分裂初期から装置の中心的存在であることを示した。

図1　シゾンの細胞分裂周期の模式図

葉緑体の分裂（cp:緑）、ミトコンドリアの分裂（mito:赤）、細胞核（青）の分裂と微小管（黄色）の形成を示す.中央には推定される細胞周期を示している。

図2　オルガネラ分裂装置の模式図

ミトコンドリア（左）と葉緑体（右）は共通の分裂機構を持つ。FtsZは内膜の内側（高等なミトコンドリアでは存在しない）、Dynamin（Dnm）は外膜上、MDringは外側と内側、PDringは外側と膜間と内側に存在するが、図には最も顕著である外側のPD/MDrinqのみ示すo（文献2、3、4）

図3　微小管とミトコンドリアの関係

シゾンの細胞周期に従って起こる一連の現象を示す。葉緑体は位相差像（PC）の明るい領域として見える。ミトコンドリア（mito:赤）は抗mtEF-Tu抗体、微小管（αTub:緑）は抗α-Tubulin抗体、DNA（青）はDAPIで蛍光染色した。微小管の極はミトコンドリアの端に形成され、ミトコンドリアに沿う微小管が見られる。紡錘体の伸長に従ってミトコンドリアが移動する。Bar:1μm

図4　紡錘体極とミトコンドリアの結合を示す電子顕微鏡像

急速凍結で細胞を固定、包埋して超薄切片にして透過型電子顕微鏡で観察した。微小管が束になった紡錘体（矢頭）があって、その両端に極が電子密度の高い構造として見える（矢印）。極は二層からなるいわゆるSpindle Pole Body様であり、その外側の層とミトコンドリア外膜が結合する構造（二重矢頭）が見える。CはBの拡大。cp:葉緑体、m:ミトコンドリア、Bar:（AとB）200nm、（C）50nm（文献5）

図5　細胞周期および微小管形成とオルガネラ分裂との相関

細胞分裂に入る前の段階で微小管重合阻害剤のOryzalinあるいは細胞核DNA複製阻害剤であるCamptothecinで処理した同調培養細胞における葉緑体（位相差像: PC）、微小管（緑:αTub）、ミトコンドリア（赤:mito）の変化。A:コントロール（DMSO処理）では分裂したミトコンドリアをつなぐように紡錘体が形成されている。

B:Oryzalin処理では微小管は完全に破壊される。葉緑体は分裂を終え、ミトコンドリアは萎縮しているが分裂を完了して2つになっている。

C:Camptothecin処理では微小管は紡錘体にはならず、葉緑体は分裂しているがミトコンドリアは分裂せずに伸びている。

D:Cの状態からさらに培養を続けると葉緑体のみの分裂が繰り返されて多数の葉緑体を持つ異常な細胞が現れる。Bars:1μm

図6　微小管とDnm1の局在的相関

紡錘体形成時には片方の極からミトコンドリアに沿って斜めに延びる微小管があり、対側のミトコンドリアの分裂面に達するように見える。Dnm1は分裂後に一方のミトコンドリアに付随する傾向があるが.その方向性と微小管の配向に相関が見られるBar:1μm（文献5）

図7　オルガネラ分裂たんぱく質の同調培養下での量的変化

同調培養細胞を二時間おき（細胞分裂前後の33hから39hの間は一時間おき）にサンプリングし、各タンパク質に対する抗体でImmunoblotを行なった。Dnm1以外は分裂期（34h-38h）に一過的な上昇を示す。mito:ミトコンドリアタイプ、cp:葉緑体タイプ

図7　細胞周期に呼応するDnm1の局在変化とミトコンドリア分裂

Camptothecin、Oryzalm、およびプロテアソーム阻害剤であるMG132で処理した細胞におけるDnm1の局在を解析した。

A:Camptotecin処理では細胞周期はS期で停止し、Dnm1は細胞質に分散した状態でミトコンドリア分裂は抑制されている。

B:MG132処理ではM期で停止し、ミトコンドリアの分裂は完了している。このときDnm1は分裂面に集合した状態である。

C:Oryzalim処理ではM期で停止し、さらに微小管が破壊されている。ミトコンドリアの分裂は終わってDnm1は集合した状態だが時間と共にミトコンドリアから離れる傾向が見られたBar:1μm（文献5）

図8　細胞周期に依存するDnm2とFtsZ2の合成と分解

Oryzalin、MG132、Campiothecin、および翻訳阻害剤であるCycloheximideで処理した同調培養における各タンパク質の蓄積量変化をImmunoblotで解析した。

A:実験の流れ。同調培養における二回目の明期11時間目（L11）に薬剤投与した。細胞の回収は薬剤投与前（L11）、4時間後（D3）および8時間後（D7）に行なった。

B:各抗体によるImmunoblotの結果。FtsZ2とDnm2は共にS期で合成されM期で分解される。FtsZ2の分解はCycloheximide処理によって阻害される。Cont:コントロール（DMSO処理） Orz:Oryzalm処理、MG:MG132処理、Cmp:Camptothecin処理Cyh:Cycloheximide処理、Cm/Cy:CmpとCyhの同時処理。

図9　Cycloheximideによって引き起こされる葉緑体分裂の途中停止

Cycloheximide処理下の細胞（図8Bの★）では、Dnm2の分解は起こるがFtsZ2の分解が起こらず、また細胞分裂も阻害される。そのような細胞では一度分裂を終えた葉緑体が再び伸長しており、FtsZ2はその両方の葉緑体の中央に局在するが、それ以上は分裂が進行しないChl:葉緑体の自家蛍光、Bar:1μm

図10　オルガネラ分裂装置の精製

オルガネラ分裂装置の単雛法を構築し、構成タンパク質を解析した。

A:単離精製行程の概略。

B:得られた最終分画の電気泳動像（10%SDS-PAGE、CBB染色）とmmunoblotの結果。細胞は1:Control（DMSO処理）、2:Oryzalin処理、3:Camptothecin処理し、同調培養第二暗期の7時間目に回収した（図8A参照）。

約2.5mg proteinに相当する細胞破砕液からの精製物をCBB染色に用い、その1/4量をImmunoblotに用いた。間期（1）にはほとんどタンパク質は見出されないが、M期停止（2）ではDnm1が、S期停止（3）ではDnm2が主要なバンドとして得られる。そしてDnm1とDnm2の他に*および**のバンドが存在する（拡大図）。

図11　新たなミトコンドリア分裂装置タンパク質

図10で得られたバンド（*と**）のタンパク質を質量分析で同定した結果、同一のタンパク質CMR185Cであった（A）。抗体染色によって細胞内局在を見ると分裂初期から最後まで分裂装置として存在した（B）。Dnm1との共局在性はその後半に著しい（C）。Bars:1μm

本論文は、序論、主要成果を述べた三つの章、考察及び展望よりなる。

序論では、ミトコンドリアの複製機構が細胞増殖とどのように関連しているかを研究する意義について述べられている。即ち、エネルギーの生産を担うこの細胞小器官は真核細胞では不可欠であるが、高等生物の場合数が極めて多いのでその解析はほとんど不可能である。ところが、ここで対象とされている単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（以下シゾンと略す）では、核、葉緑体、ミトコンドリアが一つしか存在しない。このような単純な構造をしている生物においてはミトコンドリアの増殖機構と細胞分裂がどのように関連しているかが明らかに出来ると期待できる。しかも、シゾンの全ゲノム情報は、2004年に決定されたので、それら分子情報と対比できるという利点もある。

第一章では、微小管構造とミトコンドリアの関係について述べられている。これまで、ミトコンドリアの分配に微小管が関与していると観察されてきたが、シゾンで見出されたのは、紡錘体極構造と密接に関わって分配するというユニークな構造が見出されたことであり、確実な分配機構を支える様式と判断された。

続いて、第二章では、シゾンでは、ミトコンドリアや葉緑体の分裂には微小管は必要ではないが、前者の分裂はM期におこり、後者はS期でおこるという差異が見出された。それぞれの分裂には、FtsZ、ダイナミンタンパク質が関与しているが、このような差異を生み出すのは、ミトコンドリアに固有のダイナミンDnm1タンパク質がM期に特異的にミトコンドリアに集合するためであると結論された。シゾンの葉緑体の分裂がS期で起こることについては、FtsZ2とDnm2双方の合成がその時期に起こることに起因し、M期においては分解されるためであると結論した。

第三章では、これまで葉緑体の分裂装置の情報はあるもののミトコンドリアの分裂装置については欠けていた点について研究を進めた。このためミトコンドリア分裂装置に関わるタンパク質の探索を、単離とその構成成分の同定により遂行した。その結果、ミトコンドリアに見られる分裂（MD）リングを担うと思われる新奇の巨大タンパク質Mda1が同定された。免疫電子顕微鏡観察でこのタンパク質が、MDリングに局在することからミトコンドリアの分裂に関わる重要な役割を担うタンパク質であると結論した。

以上のような新知見を踏まえて、単細胞紅藻シゾンでのミトコンドリア分裂増殖の細胞周期ネットワークにおける動態を論議し、ミトコンドリア分裂の機構について新しいスキームを提出した。

なお、本論文第一章は、三角修己、長田敏行、黒岩晴子、黒岩常祥等との共同研究であり、また、第二章、第三章も上記のものとの共同研究ではあるが、研究の主要部分は、論文提出者の独自のアイデアで展開され、遂行されたものであるので、論文提出者の寄与は十分であると判断される。

これらの情報の下、博士（理学）の学位を授与できると認める。