Introduction

With continuously growing demand for treatment strategies, the researchers in bioengineering and medical fields have paid much attention on regenerative medicine. By using stem cells of patient, we can heal severe illness and repair damaged organs. Doing research of stem cells needs efficient separation processes to specifically separate stem cells from bio-fluidic mixture. Micro magnetic-activated-cell-sorting （MACS） process can give effective selection, high purification of product, and reduction in a large amount of cell sample and operating cost. Performance of MACS process relies on the number of cells attached to magnetic beads, thus mixing of cells and magnetic beads is a crucial process. In the last decade, researchers have proposed and fabricated many kinds of passive and active micromixers, which can hopefully overcome any difficulties of mixing in micro-scale devices. Those can be categorized into active and passive micromixers.

Evaluating the mixing efficiencies is vital to reveal the potentials of the mixers for designing the other components of bio-fluidic processing and also to improve the mixing. Due to micro-scale devices, monitoring the performances becomes more difficult in experiments. In addition, most experimental results are two-dimensional information. This may cause us to lack or to misinterpret some important mechanisms of mixing. With numerical simulations, we can obtain more details of mixing as well as three-dimensional information.

The objectives of this study are to numerically assess and to analyze the performances of a passive and an active micromixers that are used for enhancing the attachment of magnetic particles onto biological molecules suspended in the medium. Two selected mixers are the serpentine micromixer using time-dependent magnetic force [1] and the lamination micromixer [2]. With these mixers, efficient mixing is possible to achieve even at Re ~ 1, and cells will not be damaged by operation conditions of the mixers. Consequently, these mixers have high potentials to be used in micro bio-fluidic processes with magnetic beads.

Methodology

The stationary flow of Newtonian fluids is computed in spatially periodic domain. Since variables such as concentration of particle on each cross section are not spatially periodic and must be calculated throughout the whole units of a mixer, we conduct the mixing calculations in the mixer units, which are serially connected.

For indicating the mechanisms of mixing, the one-way coupling Lagrangian particle tracking simulations are performed on the motion of the magnetic bead and cell particles in both mixers. The beads and cells are assumed to be rigid spheres of 1μm in diameter. In addition, the Brownian motion is neglected

Performances of the mixer are evaluated by conventional measures of chaotic system such as the largest Lyapunov exponent and Poincar〓 section, and also by alternative measures such as the contact ratio, which is the ratio of number of cells attached by beads to total number of cell at the outlet of mixer, and the nearest distance, which is a proposed quantitative measure.

Active mixer: serpentine micromixer using time-dependent magnetic actuation

The Idea of mixing is to utilize magnetic forces to move magnetic beads across the streamlines of fluid. With alternating the magnetic-control signal, the beads can be stirred and dispersed in the mixer. The magnetic forces are generated from electrodes, which are embedded in the bottom wall of mixer. A unit of mixer is composed four electrodes and a cycle of magnetic actuation has four phases.

In present simulations, a mixer is composed of 9 units and magnetic forces are applied from unit 4 to 8. Controlling parameters are amplitude and frequency of magnetic actuation. Normalized amplitude is the ratio of maximum velocity due to magnetic force to bulk mean velocity of fluid,α. Normalized frequency denotes as Strouhal number, Str = f L/（4U）, where L and U are length of mixer in one unit, and bulk mean velocity of fluid, respectively. The operation conditions of magnetic actuation are in the range of 0.25 〓 Str 〓 2.0 and 0.39 〓α 〓 6.19, and the introducing rate of bead to cell particle is unity.

In two-dimensional simulations, Re is equal to 0.0032. From the simulation, we have reached the following conclusions:

Operating the sequence of magnetic actuation in the direction same as flow gives mixing better than in the opposite direction. With performing the sequence in opposite direction, magnetic force induces beads to move against flow therefore beads move slower than cell particles, which is not influenced by magnetic flow.

In order to evaluate the efficiency of mixing of beads and cells, the number of cell attached by magnetic to the total number of cells is more suitable measure than the largest Lyapunov exponent （λ）. For instance, large amplitude force of　α = 6.19 when Str = 1.43, gives a negative value of λ even if a large number of cell particles is attached by beads.

Movement of magnetic beads toward the region of cells depends on the relative velocity of beads increased by the magnetic force. With larger amplitude force, beads suddenly get access into the region of cells. When α ~ 1.0 and Str = 1.0, the, magnetic beads can have high drift to increasingly disperse from upstream to downstream, and also to deeply move into the region of cells, resulting in maximized value of contact ratio. With this condition, the number ratio of bead attaching on a cell is ~ 2:1. In addition, extending more mixer units, which utilize magnetic force gives higher value of contact ratio.

The number of cells attached to beads increases as the increase of α. The Strouhal number, Str, directly affects the dispersion of beads. A large number of dispersion （thus, a higher contact ratio） is attained when Str = 1.0 except for the case with very large amplitude of magnetic actuation, where magnetic beads are trapped around the inner edges of electrodes. Even though, the contact ratio is maximized when α = 6.19 and Str = 1.43, the number ratio of beads attaching on a cell is large （~ 6:1）.

In three-dimensional simulation, the Reynolds numbers are in the range of 0.0032 〓 Re 〓 0.048. From simulations, we found that due to magnetic force in gravity direction magnetic beads were driven toward the bottom wall. In addition, influences of lift forces and the Brownian motion on beads are not strong to push beads up to the region of high velocity of fluid. Consequently, beads sink and move on the bottom wall: the mixing is not good in three-dimensional simulation.

Passive mixer: lamination micromixer

Idea of the mixing is to split and to recombine flows. Splitting and recombining flows can reduce the thickness （distance） between layers of two fluids. After passing a unit of mixer, the thickness between different fluid layers will be reduced in half. Ideally, the decrease of the thickness is proportional to 2 power of −n, where n is number of mixer units. Mechanisms of the mixing at Re = 1 are clarified through both ideal topological analysis and Poincar〓 section.

From Poincar〓 section, thickness of fluid layers distorts and is not uniform. This is due to effect of shear force from many sharp bends in the mixer. In addition, the existence of four periodic unmixed islands, where a large number of same particles accumulate together, is found near the centre of conduit. Particles inside these islands have high velocities. In every four units of mixer, these islands come back to the same position. To quantify performances of this mixer, we measure the scale of segregation and the nearest distance. Results from both mixing indices are consistent each other, and tend to reach the constant values. Accordingly, increasing number of mixer units more than 15 units will not much improve the mixing.

These periodic unmixed islands are occurred because streamlines confine to stream surface, so-called Kolmogorov-Arnold-Moser （KAM tube）. This causes particles inside the islands to not move away from the islands. From the nearest distance method, sizes of unmixed islands on the exit plane of unit 15 occupy ~ 6 % of cross section area, and the average thickness of fluid layer is ~ 4.4 μm.

In order to destroy the unmixed islands, we have performed three strategies, i.e., increasing Reynolds number, using uneven cross-section mixer, and alternating rotation of flow. First results show that when Re = 24, effect of secondary flow dominates on the motion of particles. Regions of accumulating particles move close to the wall and the mixing around the centre of conduit is better. From the nearest distance method, performance of mixer is a bit improved, i.e., ~ 6.7 %. Next, in uneven cross-section mixer, the unmixed islands still exist and most particles move in the bigger cross section. Mixing becomes worse and the average thickness is larger when the aspect ratio is smaller. This is because mechanism of the mixing exhibits similar in the original design. Finally, by using the alternating rotation mixer at Re = 1, the unmixed islands found the original design are not observed. With alternating rotation, streamlines are gradually crossed together, hence the periodic unmixed islands do not occur in this mixer. The average thickness is smaller ~ 48%.

Conclusion

In two-dimensional simulations of active mixer, mixing of bead and cell particles can be promoted by controlling the amplitude and frequency of magnetic actuation at the same order of fluid flow, i.e. α ~ 1 and Str = 1. Due to high drift on the motion of beads, beads can much disperse and deeply get access into the region of cells. When α = 6.19 and Str = 1.43, the value of contact ratio is maximized but the number ratio of bead attaching to a cell is large. In three-dimensional simulations, due to influence of magnetic force in gravity direction, magnetic beads sink on the bottom wall, resulting in bad mixing.

In the passive mixer at Re = 1, existence of periodic unmixed islands is observed and in every four units of mixer, these islands will come back to the same positions. A proposed quantitative measure, named the nearest distance method, can use to evaluate the performance of lamination mixer. Three strategies are performed for enhancement of the mixing. When Re = 24, effect of secondary flow dominates on the motion of particles, and mixing is improved by ~ 6.7%. With mixer alternating rotation, the unmixed island is not observed even at Re = 1, and mixing is improved by ~ 48 %. But with uneven cross section, mixing becomes worse.

本論文は，Performance Assessment of Micromixers for Bio-fluidic Processing with Magnetic Beads（磁性粒子を用いたバイオフルイディック・プロセッシングのためのマイクロ混合器の性能評価に関する研究）と題し，6章より成っている．

近年のマイクロ加工技術の急速な発展に伴い，従来の生化学分析プロセスをチップ上にマイクロ化・集積化する研究が注目を集めている．システム全体の微小化・自動化により，必要サンプル量の大幅削減，人的労力の削減，分析時間の大幅短縮，さらには，微小デバイスのみに可能な高付加価値（単一生体分子の操作，検出など）などの利点が期待されている．このような微小スケールシステムにおいては，流体や混入物質の混合が非効率的となる．したがって，試料・試薬などの混合をいかにして促進するかが非常に重要な課題となる．本論文は，抗原抗体反応を基にした磁性粒子による細胞の選択分離プロセスをマイクロ化した際の，磁性粒子と標的細胞の混合促進手法に関する数値的・理論的研究を行ったものである．

第一章は序論である．まず，再生医療とその可能性について概観した後，その第一段階として特定の細胞を抽出する際に細胞への負担が少なく且つ信頼性の高い抽出手法の開発が必要であると述べている．次に，細胞抽出手法として蛍光標識分離法（ＦＡＣＳ）と磁気標識分離法（ＭＡＣＳ）について概説し，細胞への負担の観点からＭＡＣＳが有利であり，さらにこれを微小化することにより高効率なシステムを構築できると述べている．微小システムにおいてはレイノルズ数が小さくなることから，必然的に流体や混入物質の混合が非効率的となることを指摘した上で，従来提案された混合促進デバイスについて，流路形状の工夫などによる受動デバイスと変動圧力・外部磁場など外部駆動力を用いる能動デバイスに分けて概説している．このうち，抗原抗体反応と磁性粒子を用いたマイクロ細胞分離システムを念頭におき，能動デバイスとしてはSuzuki et al. （2004）によって提案されたマイクロ磁気混合器を，及び受動デバイスとしてはTan et al. （2005）によって提案されたマイクロ積層混合器を，本研究における数値解析の対象とすることが述べられている．また，本数値解析を通じて用いられた仮定がここにまとめられている．

第二章では，本研究で用いられた数値計算手法，及びマイクロ混合器の性能評価指標が詳述されている．連続相である液体の基礎方程式，即ち非圧縮性ナヴィエ・ストークス方程式は，二次中心差分を用いて空間的に離散化し，数値安定性及び精度に優れた三次ルンゲ・クッタ／クランク・ニコルソン法に基づくフラクショナル・ステップ法を用いて時間積分している．また，蛇行する複雑な形状の流路を計算対象とするための手法として埋め込み境界法を採用し，計算の高効率化をはかっている．細胞及び磁性粒子は固体粒子の質点として扱い，その運動をラグランジュ的に追跡する手法をとっており，その運動方程式はクランク・ニコルソン法を用いて時間積分している．マイクロ混合器の性能評価指標としては，従来の研究で用いられた指標について概観した後，本研究において適当なものとして，ポアンカレ断面，リアプノフ指数といったカオス力学における指標，及び，磁気粒子の細胞への付着割合，粒子密度変動，乖離長さスケールといった工学的な指標を用いることが述べられ，これらの定義及び計算手順が詳細にまとめられている．

第三章では，能動混合デバイスであるマイクロ磁気混合器（Suzuki et al., 2004）を取り上げ，印加する外部変動磁場が磁性粒子の混合，及び磁性粒子の細胞への付着割合に与える影響を検討している．混合器の形状は二次元的な蛇行流路であり，これに複数取り付けられた電極を用いて時空間的に磁場を変動させるようになっている．数値解析は，まず二次元平面内の運動に関するものについて行われている．それによると，基本的な制御パラメータは，変動磁場の周波数の無次元数であるストローハル数と，磁場によって駆動される粒子の終端速度と連続相流体の平均流速の比である強度係数の二つであり，この二つのパラメータを変化させることで混合の状態が顕著に変化することが示されている．リアプノフ指数を指標とした場合に混合が最も促進されるのはストローハル数，強度係数ともに1のオーダーの場合であるが，より実際的な指標である付着割合を用いると，上述の条件のほかに，強度係数が6程度の場合にも粒子と細胞の付着が顕著になることが示され，この二つの条件における付着割合の極大化が異なる機構によるものであることが粒子運動の可視化を用いて示されている．次に三次元解析を行なったが，全ての磁性粒子が底面に沈降するという結果が得られている．この現象について理論的な検討及び実験（Suzuki, 2003）との比較を行なった結果，磁性粒子を重力と逆方向に駆動する力の存在は考えにくく，したがってこの混合器を用いて起こる磁性粒子の混合が底面近傍における二次元的なものであると結論付けられている．

第四章では，受動混合デバイスであるマイクロ積層混合器（Tan et al., 2005）を取り上げ，理想的な条件で理論的に予測される混合性能と，実際の混合性能の比較を行なっている．混合器の形状は三次元的な蛇行流路に分岐・回転・合流を合わせた形となっており，基本的には流体層を分割し層状に重ねることによって混合距離を小さくするという原理に基づいている．理想的な条件では混合器のユニット数をnとした場合に2のn乗個の層が出来るため，混合距離はその逆数に比例することとなるが，数値計算を行なった結果，約4ユニット以上では混合距離の減少が飽和する結果が得られている．この原因について，ポアンカレ断面を用いて粒子の運動を解析した結果，4ユニットを周期とする軌跡が存在すること，またこの周期点近傍の粒子が島状の構造を形成し，この領域では混合が起こらないこと等を示している．さらに，この島状構造が形成される原因として，流路の分岐・回転・合流の方向がいつも同じであることにあると結論づけている．そこで，この問題点を解決するために，混合器1ユニットごとに分岐・回転・合流の方向が交互に変わる混合器形状を新たに提案している．数値計算の結果，島状構造の形成が抑制されること，また定量的にも元の混合器よりも高い混合性能が得られることが検証されている．

第五章では，前二章で展開した議論を踏まえ，実用場面における能動デバイスと受動デバイスの一般的な比較を試みている．また，これに関し，数値解析では無視されていたが磁性粒子及び細胞が受けるであろう分子拡散の効果の概算を行なっている．

第六章は結論であり，本論文で得られた成果をまとめている．

以上，本論文では，マイクロ流路内において磁性粒子及び細胞の混合を促進するデバイスの数値シミュレーションを用いた評価およびその改良設計を行った．外部変動磁場を用いた混合器に関しては，二次元平面内の混合及び細胞への付着を最大にする制御パラメータを明らかにするとともに，このデバイスで起こる混合が二次元的なものであることを示した．積層型混合器に関しては，提案されている形状の流路における粒子運動を詳細解析するとともに，理想的な混合が行なわれない原因及びその機構を指摘し，これら解析に基づき，より優れた混合器を提案した．本論文で用いた数値解析手法，提案した定量的指標，及び得られた混合促進機構に関する知見は汎用性の高いものである．従って，本論文は，マイクロ生化学分析分野のみならず，微小スケールの熱流体制御手法についての新たな知見を加えるもので，熱流体工学をはじめ機械工学の上で寄与するところが大きい．

よって本論文は博士（工学）の学位請求論文として合格と認められる．