Introduction

Nuclear magnetic resonance spectroscopy （NMR） is a powerful tool to identify organic compounds and to analyze the structures of biopolymers in organic chemistry and biochemistry. The application of NMR spectroscopy to food science is recently being tried because it is non-destructive, selective, and capable of simultaneous detection of compounds in complex mixtures. In this study we tested the potential of NMR spectroscopy as a tool for the analysis of milk. Milk compositions were detected by NMR spectra without any pre-treatment, and their existing states were also studied in milk. Colostrum was also analyzed by NMR spectroscopy in the same way. Compounds only existing in colostrum were detected for the first time. Because the amplitude or area of NMR signals is proportional to the concentration of the corresponding molecule in the observed volume, 1H, 31P 1D and 1H-13C HSQC 2D spectra were applied to the quantification of various milk compounds. Time course study of phosphorylated compounds in colostrum was performed by 31P 1D spectra, which provided useful information on relative rates of synthesis of important milk constituents. The target of this research is to establish an effective and nondestructive NMR technique for detection and quantification of complex mixtures such as drinks and body fluids.

The Analyses of Commercial Milk by NMR Spectroscopy

One- （1H, 13C） and two−dimensional （1H-13C, 1H-15N, 1H-31P） NMR spectra of commercial milk were observed directly without any pre-treatment. The signals in each NMR spectrum were assigned, and their existing states were also analyzed. Lactose exists in a free state in milk. The signals due to the butyric acid chain can be assigned among the other fatty acid chains. Monounsaturated fatty acid （oleic acid chains） and polyunsaturated fatty acid chains （linoleic and linolenic acid） were assigned by their characteristic signals. The signals from citrate, N-acetylcarbohydrates, and lecithin could be observed directly in the 1H-13C HSQC NMR spectra; the assignment of their signals was made through the 1H-13C, 1H-15N, and 1H-31P HMBC spectra of extracted milk. Signals from creatine and N-acetylcarbohydrates were detected for the first time. The 1H-13C HSQC spectrum of commercial milk was shown in Figure 1.

Commercial milk has also been quantified using 1H 1D and 1H-13C HSQC 2D NMR spectra. Fat content of commercial whole milk was detected to be 3.61 ± 0.08%, and lactose content was detected to be 47.77 ± 1.01mg/ml by 1H NMR spectra. Concentrations of citrate, N-acetylcarbohydrates, butyric chain, total unsaturated fatty acid, total multi-unsaturated fatty acid and lecithin were detected to be 3.16 ± 0.22, 2.87 ± 0.11, 18.53 ± 1.44, 41.91　± 2.76, 2.86　±　0.33 and 4.04 ±　0.59 mM, respectively, by 1H-13C HSQC spectra. This is the first quantification of milk compositions using 2D NMR spectra.

The Analyses of Colostrum by NMR Spectroscopy

Colostrum has also been analyzed by NMR spectroscopy. The one- （1H, 13C, 31P） and two-dimensional （1H-13C HSQC, 1H-31P HMBC） NMR spectra of colostrum were successfully obtained. Fat content of colostrum in the first day postpartum was much higher than that in commercial milk as detected by 13C NMR spectra. In the 1H- 13C HSQC spectrum of colostrum, signals due to creatine and methylene groups of lecithin could be detected directly, while these signals were not observed in that of commercial milk. Phosphorylated compounds existing in milk were thoroughly studied by 31P 1D and 1H-31P HMBC 2D NMR spectra. UDP-glucose, UDP-galactose, phosphocreatine, glucose-2-P and galactose-2-P only exist in colostrum. Especially, glucose-2-P and galactose-2-P were detected only in colostrum in the first and second day postpartum for the first time. Contents of phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine and choline phosphate were much higher than that in commercial milk.

Phosphorylated compounds （UDP-glucose, UDP-lactose, phosphatidyl choline, phosphatidyl ethanolamine, phosphocreatine and choline phosphate） occurring as lactation progressed from day 1 to 30 have been quantified easily by 31P NMR spectra.

Conclusion

Commercial milk and colostrum have been successfully studied using NMR spectroscopy. General compounds such as fatty acid and lactose were easily detected in 1H and 13C 1D NMR spectra. Minor compounds such as phosphorylated sugars, creatine and phospholipid were also detected by the combination with various NMR measuring methods. Most of them were detected in milk for the first time. Compounds existed in commercial milk were quantified by 1H 1D and 1H-13C HSQC 2D spectra. Time course study of phosphorylated compounds in colostrum was performed by 31P 1D spectra. This research showed the convenience, sensitivity and efficiency of NMR spectroscopy. NMR spectroscopy is considered to be applicable to quality control or specification of various types of mixtures.

Figure 1. 1H-13C HSQC spectrum of commercial milk

本論文は、様々なNMR測定手法を組み合わせることによって、牛乳成分の非破壊的定性、定量分析及び各成分の牛乳中における存在状態について研究した結果について述べている。本論文は第一章の序論、第六章の結論を含む全6章からなる。

第一章においては、NMR測定法の原理と歴史全般の概説を行い、NMR測定法の食品分野への応用及びその意義について述べている。また現在牛乳成分の分析に使われている一般的な測定方法についても述べ、それらの方法とNMR測定法の比較を行い、NMRを用いた牛乳の非破壊測定の目的と意義を説明している。

第二章では、市販牛乳のＮＭＲ測定について述べている。市販牛乳の1次元NMRスペクトル（1H NMR、13C NMR、31P NMR）及び2次元NMR スペクトル（1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、1H-15N HMBC 及び1H-31P HMBC）を測定した。牛乳中の成分トリアシルグリセロールと乳糖に由来するシグナルの帰属に成功した。また、微量成分であるクエン酸イオン、レシチン、クレアチン、N-アセチル糖など化合物のシグナルも帰属に成功した。

第三章では、1次元1H NMR及び2次元1H-13C HSQCスペクトルを用いた牛乳の各成分の定量について述べている。まず、1H NMRスペクトルを用いて牛乳の総脂質含量及び乳糖含量を簡便に計算することができた。次に、牛乳の1H-13C HSQC NMRスペクトルを用いて、牛乳に含まれているクエン酸イオン、N−アセチル糖、トリメチルアミン、酪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸を同時に定量することができた。NMRスペクトルにより定量した牛乳の各成分の含量は、文献値とほぼ一致していることを明らかにした。

第四章では、ウシの初乳のNMR測定について述べている。分娩後1日目のウシ初乳の13C及び1H NMRスペクトルを市販牛乳のスペクトルと比較したところ、乳脂肪のメチル、メチレン基に由来するシグナルの高さは市販牛乳のほぼ4倍であった。したがって、1日目の初乳の脂肪含量は市販牛乳の約4倍であることが示された。乳糖に由来するシグナルの高さによると、初乳と市販牛乳中の乳糖含量はほぼ同じであった。1日目の初乳の1H−13C HSQCスペクトル上にクレアチン及びレシチンのシグナルが直接観察され、それらの成分の濃度は市販牛乳より高いことが示された。次に初乳及び市販牛乳中のリン化合物を31P 及び1H-31P HMBC NMRスペクトルにより調べた。市販牛乳中から無機リン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、コリンリン酸及び糖-1−リン酸が検出され、初乳からは上記に加えてUDP糖、クレアチンリン酸、糖-2−リン酸も検出された。一日目の初乳からHPLCを用いてUDP糖と糖-2−リン酸を精製し、NMRスペクトルを測定した結果、それらの成分がUDP−glucose, UDP-galactose及びglucose-2-P, galactose-2-Pであると同定した。

第五章では、1次元31P NMRスペクトルから分娩後1ヶ月の牛乳中のリン化合物の成分変化について述べた。分娩後1日目の初乳中にglucose-2-P とgalactose-2-Pの存在が確認され、2日目までに消失した。UDP−糖は初乳に濃く含まれ、徐々に減少し10日目までにはUDP−糖は消失した。ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの含量は1日目において濃度が高く、最初の3日間で含量が急激に下がり、4日目以降は低含量で落ち着いた。クレアチンリン酸とコリンリン酸の含量は、分娩後1ヶ月の間で徐々に下がったが、その変化はそれほど大きくなかった。

以上、牛乳のNMR測定を行った結果、牛乳中の成分について非破壊的に1次元及び2次元NMRスペクトルにより定性、定量することに成功した。さらにウシ初乳と市販牛乳の違いをNMRにより解明し、初乳から新しい成分を検出し、同定した。今回の研究で確立されたNMR測定法は食品や医薬品などの成分分析及び品質管理に貢献するところが少なくない。よって、審査委員一同は、本論文が博士（農学）の学位論文として価値あるものと認めた。