Nonhuman primates have been used extensively as models for human disease. In particular, the common chimpanzee （Pan troglodytes）, which belongs to the superfamily Hominoidea, has been used as a human model for the study of diseases such as human hepatitis C virus （HCV）, human hepatitis B virus （HBV）, and human immunodeficiency virus （HIV） infections, to which only human and chimpanzee are susceptible. In each case, a complete understanding of these models requires knowledge of the MHC genes. There two major classes of MHC molecule, MHC class I molecule and MHC class II molecule. Especially, MHC class II molecules are heterodimeric cell surface glycoprotein that play a critical role in immune response by binding peptides and presenting them to T cell. In the present study, polymorphisms in the Patr　MHC class II B1 allele were analyzed by sequencing of exon 2 region. For effectively identification of Patr MHC class II alleles, I developed an applied or modified typing technique on each Patr-DPB1, -DQB1, and -DRB1 alleles. The present study was consisted of chapter 1, chapter 2 and chapter 3 as follows.

Chapter 1. Sequence analysis of MHC class II DPB1 gene in chimpanzees （Pan troglodytes）

In the Patr-DPB1 alleles, I applied to both cloning and direct sequencing. In order to design suitable primer pair which amplify exon 2 of Patr-DPB1 alleles, a fragment of approximately 8 kb from exon 1 to exon 3 was amplified from chimpanzee genomic DNA. After designing 500-bp primer pair at the 3' region of intron 1 and the 5' region of intron 2, the analysis of DPB1 exon 2 alleles of each chimpanzee was carried out. Particularly, the application of direct sequencing was useful to exclude a PCR error occurred during cloning and sequencing. I identified seven alleles on the Patr-DPB1 gene, including one　new allele in the tested twenty-two chimpanzees. The results suggest that Patr-DPB1 alleles is characterized by genetic variations such as the exchange of sequence motifs and the accumulation of point mutations than other Patr MHC class II regions.

Chapter 2. Sequence analysis of MHC class II DQB1 （Patr-DQB1） alleles in chimpanzees by PCR-based methods

PCR-RFLP method and cloning and sequencing techniques were applied in this chapter. As a result, these methods were useful for the determination of Patr-DQB1 alleles and effectively detected mutations occurred in new alleles. Particularly, PCR-RFLP analysis using specific restriction enzymes for each Patr-DQB1 lineage was available for panel of Patr-DQB1 lineages involved individual chimpanzee. The six Patr-DQB1 alleles including two new alleles were identified in twenty-five chimpanzees. And, the obtained nucleotide sequences and phylogenetic analysis indicated well the lineage-specific character of the Patr-DQB1 alleles.

Chapter 3. Identification and analysis of MHC class II DRB1 （Patr-DRB1） alleles in chimpanzees

In the Patr-DRB1 alleles, I attempted the selective identification using PCR technique applied with three steps: first, I performed Patr-DRB1*02 lineage-specific 8-kb PCR for *02 lineage detection in each chimpanzee; second, I performed 620-bp PCR for amplification of full-length exon 2; and finally, I carried out an insert check using the pattern of microsatellite repeat length variability. In the genomic DNA of twenty-three chimpanzees, nine Patr-DRB1 alleles containing two new alleles were detected. The sequence data and the phylogenetic analysis suggest that the ・-pleated sheet contains most of the stable lineage-related sequence motifs and the ・-helical portion appears to accumulate variations. The two new alleles appeared to be primarily generated by changes in the ・-helical loop portion. In addition, the data of the microsatellite sequences of the chimpanzees analyzed in this chapter will provide a basis for examining the evolution of microsatellite sequences and for tracing the origin of individual Patr-DRB1 alleles.

In conclusion, the methods used the present study provided relatively effective identification of Patr MHC class II alleles in individual chimpanzee. Furthermore, it should facilitate colony management of chimpanzee groups in Japan and contribute to our understanding of the features of MHC molecules in non-human primates.

チンパンジーはヒトとの遺伝子的類似性が98.6%で最もヒトに近い動物であり、またC型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス感染によりヒトと類似した免疫反応を示すため、これらの感染症のモデルとして用いられている。主要組織適合性遺伝子複合体 （MHC） クラスII分子は抗原提示細胞（樹状細胞、B細胞、マクロファージ、単球、T細胞の一部など）の表面のみに存在し、生体が免疫機能を果たすのに重要な役割を担っている。MHCクラス II 領域は非常に多型性に富む一群の遺伝子座からなり、それら遺伝子機能の解明は、きわめて大きな意義をもつ。チンパンジー個体が持つMHC class II遺伝子のタイピングは日本で飼育されているチンパンジーコロニーのMHCクラスII遺伝子の多型性を維持するには必須であり、またチンパンジーを用いたHCVワクチンの開発における基礎データとしても有用である。従って、本研究ではチンパンジーにおけるゲノムのDNA 塩基配列に基づいた各MHC class II遺伝子の有用な検索法の確立と遺伝子解析を目的としている。本論文は下記の3章からなる。

第1章：チンパンジー （Pan troglodytes）のMHC class II DPB1 遺伝子に関する解析

チンパンジーDPB1のcDNA塩基配列からチンパンジーゲノムDNAのイントロン1及び 2を含む断片を増幅するプライマーを作成し、エクソン1からエクソン3までの約8kbのチンパンジーゲノムDNAの塩基配列を決定した。得られたチンパンジーDPB1遺伝子のイントロン1及び 2の塩基配列から新たなプライマーを作成し、 エクソン2全長を検索するダイレクトシークエンス法や遺伝子クローニングが可能になった。遺伝子の解析を行った結果、22頭において新たな対立遺伝子であるPatr-DPB1*29を含め7つの対立遺伝子が検出された。系統学的検索の結果、チンパンジーDPB1遺伝子は他のチンパンジーMHC クラス II 遺伝子より突然変異が多く蓄積されており、また配列モチーフの交換などにより遺伝的多型性を獲得し、種特異的な進化を遂げてきたのではないかと考えられた。

第2章：PCR法を用いたチンパンジー （Pan troglodytes）のMHC class II DQB1 遺伝子の解析

本章では、チンパンジーDQB1遺伝子についてPCR-RFLP法及び遺伝子クローニング法により塩基配列の決定を行なった。結果として、これらの方法はチンパンジーDQB1 遺伝子の決定に有効であった。特に、制限酵素を用いたPCR-RFLP法は各個体のlineageの識別に有用であった。今回25頭のチンパンジーを解析した結果2つの新規対立遺伝子を含めた6つの対立遺伝子が同定された。さらに、それらの塩基配列と近縁動物種のDQB1遺伝子の塩基配列から系統解析を行なったところ、DQB1遺伝子はlineage特異的な性質を有していたことが示された。

第3章：チンパンジーMHC class II DRB1 （Patr-DRB1） 遺伝子の識別と遺伝子解析

本章ではチンパンジーDRB1遺伝子の検出法として3段階 PCR法を基盤とする方法を確立した。まず、各個体のゲノムDNAに対し、DRB-E1+及びDRB-E3-プライマーを用いて PCRを行い、各個体が持っている*02 lineageを確認した。次に、各個体のゲノムDNAに対してエクソン2全長を含む620bpの遺伝子断片を増幅し、そのPCR産物の塩基配列を決定した。最後にイントロン2に存在するlineage特異的な構成を持つマイクロサテライト領域を増幅する新たなプライマーを作成し、その PCR産物の解析を行なった。その結果、チンパンジーDR領域にはDRB1遺伝子と類似した構造を持つ擬似遺伝子などが存在するが、DRB1対立遺伝子のみの選別が可能になった。23頭のチンパンシーにおいて新規対立遺伝子2つを含む9個の対立遺伝子を同定した。その塩基配列，アミノ酸配列、系統樹の分析の結果、βシート構造の部分は安定したlineage特異的なモチーフを示し、αへリックス構造の部分に変異が集中していることが分かった。今回見つかった2つの新規対立遺伝子の遺伝子置換もαへリックス構造の部分で起きていた。さらに、本章で明らかになったチンパンジーDRB1遺伝子におけるマイクロサテライトは各Patr-DRB1 起源やマイクロサテライトの進化を解析する上で基礎資料として活用できると考えられた。

本論文はチンパンジーMHC クラス II 遺伝子の特性に合わせた検索法を確立することに成功し、効率的にDPB1, DQB1及びDRB1遺伝子の対立遺伝子を検索している。これらの成果は、日本にいるチンパンジーの適切な繁殖維持や霊長類のMHC分子に対する理解及び研究資源としてのチンパンジーの意義を高めるものであり、獣医学領域での貢献が多大である。よって、審査委員一同、本論文が博士（獣医学）の学位論文として価値あるものと認めた。