Canine necrotizing meningoencephalitis （NME） is an unique form of non-suppurative inflammatory disease, often called "Pug dog encephalitis”. The common clinical signs of dogs with NME are forebrain signs, such as partial or generalized seizure, decreased consciousness, abnormal behavior, circling, and ataxia. Histopathologically, canine NME is characterized by a lymphocytic-plasmacytic inflammation, chronic neurodegeneration with necrotic foci, and activated astrocytes around lesions. Although the pathogenesis of NME remains unclear, previous studies suggested that NME is an autoimmune disease, detected an anti-astrocyte autoantibody in cerebrospinal fluids （CSFs）. On the other hand, many researchers demonstrated that an excess of excitatory amino acids, such as glutamate and aspartate, play an important roles in the neuronal cell degeneration and/or cell death via the synaptic excitatory amino acid receptors, including neural N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor. Excitatory amino acids increase cytoplasmic free Ca+2 concentration and induce subsequent neuronal cell death.

In the present study, based on a hypothesis that the parenchymal necrosis in the NME is caused by the glutamate toxicity, excitatory amino acids （glutamate and aspartate） in CSFs were measured in dogs with NME in chapter 1. In chapter 2, the effect of NME-CSF on glutamate transport of astrocytes was examined using in vitro model. The effect of glutamate transporter inhibitor was also examined. In addition, expressions of glutamate transporters （GLT-1 and GLAST） mRNA were investigated.

Chapter 1: Evaluation of excitatory and inhibitory amino acids in CSF of dogs with NME

Total 34 dogs （6-month to 7-year of age, 11 males, 14 females, 6 neutered-females, and 3 neutered-males）, all of which were diagnosed as NME by magnetic resonance imaging （MRI） and/or postmortem pathological examinations, were used. Samples of CSF were collected from the cisterna magna under the sedation. All samples were positive for anti-astrocyte autoantibody. Ten CSF samples from clinically healthy Beagle dogs were used as the control.

Concentrations of exicitatory （glutamate and aspartate） and inhibitory amino acids （taurine and γ-aminobutyric acid: GABA） in CSFs were measured by a high performance liquid chromatographic （HPLC） method with some modifications. In NME cases, glutamate concentrations （8.16 ・ 7.8 μM: mean ・ SD） in CSFs were significantly higher than those in healthy controls （1.40 ・ 0.8 μM: p<0.001）. Significantly higher aspartate concentrations （0.87 ・ 0.6 μM） were also found in NME-CSFs in comparison with healthy controls （0.21 ・ 0.3 μM: p<0.01）. While, taurine concentrations were also significantly higher in NME-CSFs （2.79 ・ 1.7 μM） than those in controls （1.81 ・ 0.6 μM: p<0.01）. No significant difference in GABA concentrations in CSFs was observed between NME cases and healthy controls. These results indicated that extracellular glutamate, aspartate, and taurine concentrations increased in the brain of NME dogs. The increase of extracellular glutamate, produced by excessive release and/or inadequate uptake by astrocytes, may induce an overstimulation of glutamate receptors on neurons and result in neuronal cell swelling and lysis. Therefore, glutamate-induced excitotoxicity was considered to be one of possible causes for progressive neurodegeneration observed in dogs with NME.

Chapter 2. Effects of NME-CSF on glutamate transport in astrocytes

To clarify the mechanism of elevated glutamate concentration in CSF observed in NME dogs, confluent canine astrocytes were cultured with NME-CSFs as an in vitro model. The increments of supernatant glutamate, aspartate, and taurine concentrations after the cultivation with NME-CSFs were significant higher （20.9 ± 8.6, 1.04 ± 0.6, 2.90 ± 1.3 μM, respectively） than those with control CSFs （0.06 ± 0.02, 0.08 ± 0.06, 0 ± 0.01 μM, respectivery: p<0.01）. Therefore, NME-CSFs induced increase of glutamate release and/or decrease of glutamate uptake in astrocytes. In addition, when the astrocytes were pre-incubated with a glutamate transporter inhibitor （L-trans-2,4-PDC）, supernatant glutamate concentration was significantly decreased from 10.98 μM to 6.27 μM （p<0.05）. Hence the increase of glutamate concentration in NME-CSFs was closely related to glutamate transporters, through of which remove extracellular glutamate. The NME-CSFs were considered to reduce glutamate uptake by astrocytes, resulting in an excess of extracellular glutamate concentration. In addition, expression of GLT-1 and GLAST mRNA, especially GLT-1 mRNA was decreased in astrocytes after the cultivation with NME-CSF, also suggesting the decrease of glutamate transport in aastrocytes.

In conclusion, glutamate excitotoxicity is closely related to induce the progressive neurodegeneration and neuronal cell death in dogs with NME. Certain factor in CSF of NME dogs induced an excessive extracelllular glutamate concentration by the decrease of glutamate uptake in astrocytes.

犬の壊死性髄膜脳炎は広範な脳実質の壊死をともなう進行性非化膿性の炎症性脳疾患で、若齢の小型犬、とくにパグに好発することからパグ脳炎とも呼ばれている。本症の発症機序は未だ明らかでないが、初期の病理組織学的所見でリンパ球・プラズマ細胞の浸潤が認められ、また脳脊髄液（CSF）中にアストロサイトに対する自己抗体が認められることから自己免疫性疾患の一つと推測されている。一方、神経症状をともなう様々な進行性の脳疾患で、その神経細胞死の原因の一つとして細胞外興奮性アミノ酸、とくにグルタミン酸の増加による神経細胞に対する興奮毒性が上げられている。本論文は、犬の壊死性髄膜脳炎の発症機序について興奮性アミノ酸に着目し、本症を病態生理学的に検討したもので、緒論ならびに総括を除いた以下の2章から構成されている。

第1章では、MRIで壊死性髄膜脳炎と診断した34症例（6ヶ月齢−7歳齢、）から全身麻酔下で大槽穿刺によりCSFを採取し、CSF中の興奮性アミノ酸（グルタミン酸とアスパラギン酸）ならびに抑制性アミノ酸（タウリンとγ-aminobutyric acid: GABA）濃度について検討している。採取した壊死性髄膜炎のCSFはすべて高い抗体価のアストロサイトに対する自己抗体を保有していた。壊死性髄膜脳炎CSF中の興奮性アミノ酸であるグルタミン酸ならびにアスパラギン酸濃度（それぞれ8.16 ± 7.8μM、0.87 ± 0.6 μM：平均±標準偏差）は健常犬のそれ（それぞれ1.40 ± 0.8μM、0.21 ± 0.3 μM）に比較して有意に高い値を示した。一方、抑制性アミノ酸のうちタウリン濃度（2.79 ± 1.7μM）は健常犬（1.81 ± 0.6μM、）に比較して有意に高かったが、GABA濃度に差は認められなかった。これらの結果からは、壊死性髄膜脳炎の脳内では興奮性アミノ酸であるグルタミン酸およびアスパラギン酸、ならびに抑制性アミノ酸であるタウリンが増加をしていると考えられた。とくにグルタミン酸の増加は神経細胞に対して興奮毒性を示し、細胞膨化ならびに細胞死を引き起こすことから、これらアミノ酸の増加は壊死性髄膜脳炎に認められる神経細胞死に密接に関係するものと考えられた。

第2章では、第1章で決められたアミノ酸の増加、とくにグルタミン酸増加の機序について、グルタミン酸濃度の恒常性に最も重要な細胞であるアストロサイトに注目し、申請者が開発したin vitro モデルを用いて検討している。すなわち、犬胎仔から分離した初代培養アストロサイトを壊死性髄膜脳炎8例から得たCSF（人工的に作成したCSFで50% 濃度に希釈）と、24時間培養した後、培養上清中のグルタミン酸、アスパラギン酸、タウリンならびにGABA濃度を測定した。その結果、壊死性髄膜脳炎CSFと培養したアストロサイト培養上清中のグルタミン酸濃度は有意な増加を示した（培養前2.37 ± 2.2μMから培養後22.8 ± 8.7 μM：平均±標準偏差）。一方、対照とした健常犬CSF（培養前1.15 ± 0.13μM、培養後1.21 ± 0.12 μM）ならびに人工的に作成したCSF（培養前0.24 ± 0.01μM、培養後0.24 ± 0.02 μM）との培養では、培養上清中グルタミン酸濃度に変動は認められなかった。また培養後の培養上精中グルタミン酸、アスパラギン酸、タウリン、ならびにGABAの増加量は（それぞれ20.4 ± 9.1μM、0.80 ± 0.61 μM、2.55 ± 1.6μM、1.05 ± 0.3 μM）対照とした健常犬のCSFと培養した際の増加量（それぞれ0.16 ± 0.0μM、0.21 ± 0.08 μM、0.53 ± 0.0μM、0.28 ± 0.16 μM）と比較してグルタミン酸、アスパラギン酸、ならびにタウリンで著しく大きく、壊死性髄膜脳炎CSF中に含まれる何らかの因子がこれらアミノ酸の増加に関連していると考えられた。次に、壊死性髄膜脳炎CSFにより引き起こされるグルタミン酸増加に及ぼすグルタミン酸輸送担体阻害剤（L-trans-2,4-pyrrolidine dicarboxylate）による影響を検討した。まず、壊死性髄膜脳炎CSFの濃度を0、10、20、50% として培養したところ、培養上清中グルタミン酸濃度は用量依存性に増加することから、この増加は壊死性髄膜炎CSFによるものであることが明らかとなった。さらに、グルタミン酸輸送担体阻害剤の前処置（30分間）により、培養上清中グルタミン酸の増加は有意に抑制され、この増加にはグルタミン酸輸送担体が密接に関連していることが明らかとなった。ついで、壊死性髄膜炎CSFと24時間培養したアストロサイトにおけるグルタミン酸輸送担体1（GLT-1）ならびに グルタミン酸アスパラギン酸輸送担体（GLAST）mRNAの発現を検討したところ、GLT-1 mRNAの発現の減少を認め、壊死性髄膜脳炎CSFによるグルタミン酸増加にはグルタミン酸輸送担体、とくにGLT-1の減少も関与していると推測された。

このように、本論文は未だその発症機序が明らかでない犬の壊死性髄膜脳炎の病態生理学的な検討から、グルタミン酸輸送担体、とくにGLT-1のmRNAレベルでの減少、ならびにグルタミン酸輸送担体を介したアストロサイトのグルタミン酸取り込み減少あるいは放出増加による脳内グルタミン酸の増加を見いだし、壊死性髄膜脳炎の発症機序あるいは病態発現機序の一つはアストロサイトによるグルタミン酸恒常性の破綻であることを明らかにしたものである。その内容は、獣医学の学術上貢献するものであり、よって、審査委員一同は、本論文が博士（獣医学）の学位論文として価値あるものと認めた。