近年、多くの癌について、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析が行われている。そして、癌の発生や進展のメカニズムの解明や、治療や診断のターゲットの探索が可能となり、マイクロアレイは癌の研究において有用な解析手法であると考えられる。

しかしながら、成人の癌を研究する場合、問題点もいくつか挙げられる。それは、多くの環境因子に曝されており、個人差が大きいこと、また、この解決手段の1つとして多くの症例についての解析が必要であること、である。

一方、小児癌は、成人の癌と比較して発症例数が少ない稀な腫瘍である。成人の癌との異なり、発症年齢が低く、染色体および遺伝子変異が少ない。それゆえ、環境要因による影響が少なくなり、個人差が少なくなる。また、原因となる遺伝子の探索が可能となる。このように小児癌を対象とした解析は、症例数が少ないという不利な点があるが、発癌の研究においてはよい単純系モデルであると考えられる。

そこで本研究では、小児癌の1つである肝芽腫を肝腫瘍のモデルとして、網羅的な遺伝子発現解析を行った。さらに、肝腫瘍の発生や進展のメカニズムを明らかにするために、肝細胞癌と比較することによって、肝腫瘍特異的な発現を示す遺伝子を選出した。そして、この解析により、肝腫瘍特異的な遺伝子として同定したPEG10（Paternally expressed gene 10）について、肝腫瘍における役割を明らかにすることを目的とした。

肝腫瘍において特異的に発現が亢進している遺伝子の同定

まず、肝芽腫8例（embryonaltype4例、purefetaltype4例）および正常肝4例について、オリゴヌクレオチドマイクロアレイにより12600プローブの網羅的な遺伝子発現解析を行った。12600プローブのうち、全ての症例でシグナル値が100を超えないプローブを除外し、残った5930プローブについて、階層的クラスター解析および肝芽腫で特異的に発現変化する遺伝子の抽出を行った。

階層的クラスター解析では、embryonal type、pure fetal type、正常肝が独立した群に分類されたことより、分化度により発現している遺伝子には特徴があることが示唆された。

また、正常肝で特異的に発現が亢進する遺伝子として、上位にチトクロームP450ファミリーが多く選出され、肝芽腫では肝臓の機能が正常に保たれていないことが示された。肝芽腫で特異的な発現亢進を示した遺伝子の上位50個には、インプリンティング遺伝子が6個（p57、PEG9、PEG1O、PEG3、IGF2、NDN）含まれ、このことより、肝芽腫とインプリンティング遺伝子が関連している可能性が考えられた。また、インプリンティング遺伝子の発現量を肝細胞癌において比較したところ、PEG10が高分化型から低分化型まで幅広く、かつ高頻度に発現亢進していることが明らかになった。しかし、3つのインプリンティング遺伝子（PEG9、PEG10、PEG3）のインプリンティングの状態を確認したところ、3遺伝子とも片側アレルからの発現を示し、インプリンティングの状態は正常に保たれていることが確認された。

以上の結果より、インプリンティング遺伝子は肝腫瘍で発現の亢進していること、特にPEG10が幅広くかつ高頻度に発現亢進しており、肝腫瘍関連遺伝子である可能性が示された。

PEG10のタンパク質発現解析

遺伝子の発現解析により、PEG10が肝腫瘍において特異的に発現亢進する遺伝子であることが示唆された。では、PEG10の発現亢進が肝腫瘍においてどのような役割を果たすのか解明するために、肝腫瘍においてPEG10のタンパク質が発現亢進しているのか、またその局在について検討する必要がある。また、PEG10は2つのリーディングフレーム（RF1、RF2）をもち、タンパク質の翻訳において、RF1の終止コドン手前で-1フレームシフトを起こし、RF1+RF2という融合タンパク質が翻訳されることが予測されている。よって、PEG10のタンパク質発現解析および機能解析では、内在性のPEG10タンパク質がどのように翻訳されているか、重要となる。

まず、PEG10が-1フレームシフトを起こす可能性があるかどうか、COS7細胞においてPEG10を強制発現させて検討した。結果、PEG10はフレームシフト認識配列を利用して-1フレームシフトする可能性、また、PEG10が切断を受けている可能性が示された。

次に、PEG10のタンパク質発現について解析するために、PEG10の2つのRFそれぞれに特異的な抗体を作製した。抗RF1ポリクローナル抗体および抗RF2モノクローナル抗体が得られた。これらの抗体は、強制発現させた融合タンパク質の認識も可能であった。

得られた抗体を用いて、肝腫瘍由来細胞株、胎児肝、肝芽腫、肝細胞癌、正常肝および背景肝について、イムノブロッテイング解析を行った。細胞株は、mRNAの発現量と相関して、タンパク質の発現も亢進していた。胎児肝においても、タンパク質の発現が確認された。肝腫瘍では、肝芽腫、肝細胞癌ともに背景肝より発現量が亢進していることが示された。よって、PEG10は肝腫瘍においてタンパク質の発現が亢進していることが示唆された。また、PEG10タンパク質の発現が見られた組織および細胞株では、全て融合タンパク質の存在が確認された。よって、-1フレームシフトは、内在性のPEG10でも生じていることが明らかになった。さらに、プロテアソーム阻害剤を添加したとき、融合タンパク質の量が増加したことから、PEG10がプロテアソーム系を介した切断・分解を受けている可能性が示された。

次に、抗体を用いて肝腫瘍における免疫染色を行い、PEG10タンパク質の発現が亢進する頻度、および、腫瘍組織内におけるPEG10の局在について検討した。肝細胞癌では、抗RF1ポリクローナル抗体によって、97例中41例で染色された（42.3%）。染色は、mRNAの発現と同様に、高分化型から低分化型まで幅広く見られた。肝芽腫では、抗RF2モノクローナル抗体によって、9例中6例で強い染色が見られた（66.7%）。肝細胞癌、肝芽腫ともに、細胞質への染色と、また、細胞間によって染色強度が不均一になる傾向を示した。以上の結果より、PEG10タンパク質は腫瘍細胞に特異的なタンパク質であることが明らかになった。

さらに、PEG10の細胞内局在について、共焦点顕微鏡を用いて検討を行った。発現量の高いHepG2およびHuH6、発現量の低いMCF7について、抗RF1ポリクローナル抗体および抗RF2モノクローナル抗体を用いて、染色した。結果、HepG2、HuH6ともに細胞質への局在を示した。また、ミトコンドリアへの局在も示さなかった。よって、PEG10は、細胞質全体に局在しているタンパク質であることが明らかになった。

これまでの結果より、PEG10がタンパク質レベルでも発現亢進していることが示された。では、PEG10が肝腫瘍において発現亢進することが、肝腫瘍の発生や進展にどのような影響を与えているか、注目すべき重要な点である。そこで、PEG10を発現抑制することにより、細胞株の増殖に影響がみられるかどうか、検討を行った。HuH6およびHuH7について、PEG10に対するsiRNAを導入し、48時間、72時間、96時間の細胞数の測定を行った。結果、HuH6、HuH7ともに72時間以降で、コントロールと比較して、PEG10の発現を抑制した細胞では細胞数が有意に減少した。よって、PEG10の発現量が減少することにより、細胞増殖が抑制されたと考えられ、PEG10は腫瘍細胞の増殖を促進する可能性が示唆された。

以上の結果より、本研究では、PEG10の遺伝子およびタンパク質が肝腫瘍特異的に発現していること、さらにPEG10が発現することによって細胞の増殖が促進される可能性が示された。よって、PEG10は肝腫瘍において、重要な役割を果たす遺伝子であるといえる。

本研究は、肝芽腫をモデルとして網羅的な遺伝子発現解析を行い、肝腫瘍の発生や進展に関与する遺伝子の探索を行った。そして、同定したPEG10について、タンパク質の発現解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

本研究において、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた肝芽腫の網羅的な遺伝子発現解析により、インプリンティング遺伝子が発現亢進していることが明らかとなった。また、PEG10は肝細胞癌においても高分化型から低分化型まで幅広く、高頻度に発現亢進しており、肝腫瘍においてPEG10遺伝子の発現が亢進することが認められた。

作製した抗体を用いてイムノブロッティングを行い、内在性のPEG10のタンパク質が-1フレームシフトを起こし、融合タンパク質を翻訳していることを明らかにした。さらに、COS7におけるPEG10の強制発現の結果より、マウスと同様に、ヒトでもフレームシフトに必要な配列GGGAAACを認識して、-1フレームシフトが生じていることが明らかになった。また、プロテアソームの阻害によって融合タンパク質の発現量が増加したことより、融合タンパク質はプロテアソームを介した切断・分解を受けている可能性が示された。

イムノブロッティングおよび免疫組織化学染色より、肝腫瘍におけるPEG10タンパク質の発現亢進が明らかとなった。分化型別には、高分化型組織より低分化型組織において、多くの症例で染まる傾向が見られた。PEG10は腫瘍部全体ではなく一部の腫瘍細胞で発現が亢進しており、不均一な染色性を示した。

共焦点顕微鏡を用いた観察により、PEG10の局在が核ではなく、ミトコンドリア以外の細胞質全体であることが明らかになった。さらに、細胞間で発現量に差が見られることが示された。

肝腫瘍由来細胞株で、siRNAを用いてPEG10を発現抑制することによって、細胞の増殖が減少し、PEG10が細胞の増殖を促進することが明らかになった。

以上、本論文では、肝腫瘍特異的にPEG10のmRNAおよびタンパク質の発現が亢進していることを明らかにし、また、PEG10タンパク質の翻訳および局在について解析することができた。さらに、PEG10の発現増加が腫瘍の進展を促進する可能性が示された。よって、本研究におけるPEG10の機能解析は肝腫瘍の発生のメカニズムの解明のための手掛かりになり、また、肝腫瘍の治療のターゲットになる可能性も考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。