A great deal of study has been done over the past years towards the development of drug delivery systems for therapeutic purpose based on polymeric micelles featuring longevity in blood circulation. In most studies, these drug carriers are composed of a biocompatible hydrophilic poly(ethylene glycol) (PEG) outer shell, because this polymer can prevent non-specific adsorption of the polymeric micelle to proteins and cells, so that allow the micelles to evade recognition by the reticuloendothelial system (RES). However, there has been less study on the introduction of other hydrophilic polymers on the outer corona other besides PEG to develop micellar drug delivery systems. Charged hydrophilic polymers have been used for delivery to mucosal surfaces, such as the respiratory, gastrointestinal, and urogenital tracts. Polymeric micelles with a corona made up of natural or semi-synthetic polysaccharides are investigated as well as vehicles in the oral administration of poorly-water soluble drugs. Recently, polymeric micelles based on block copolymers of PEtOx and poly(ε-caprolactone), were also evaluated as a candidate of novel drug carriers and shown to have low cytotoxicity and hemolytic activity.

In the meanwhile, of great interest is also the design of "intelligent drug carriers" able to achieve site-specific delivery of drugs. There have been developed two kinds of active targeting so far. The one is chemical affinity targeting using molecules such as sugar residues or antibodies as homing devices and the other is physical affinity targeting using pH, thermally, or magnetically responsive carriers. In particular, the physically targeted polymeric micelles utilizing temperature change could be designed to have a small size and thermo-sensitive polymer chains on their outer hydrated shell. Thus, these types of micelles are expected to present a double targeting character: passive targeting resulting from both their small size and highly hydrated shell structure, and active physical affinity targeting resulting from their thermo-sensitive outer shell.

There have been prepared the thermo-sensitive polymeric micelles from amphiphilic block copolymers composed of a thermo-sensitive outer shell (PNIPAAm) and hydrophobic inner core.[1] These micelles exhibited a small diameter with a low critical micelle concentration, providing a carrier that may have long blood circulation times and a low RES uptake. The concept of physical affinity targeting is based on the hyperthermia strategy. In short, when the temperature is increased above the transition temperature of the thermo-sensitive block chains (32 ℃), the outer shell chains dehydrate and collapse, allowing aggregation between micelles and favoring binding interactions with cell membrane surfaces. Hydrophobic molecules are shown to be incorporated into the inner hydrophobic core of the thermo-sensitive micelles. Consequently, these micelles were considered valuable for site-specific delivery of drugs using changes in temperature as a trigger. However, PNIPAAm is a non-biodegradable polymer, and its biocompatibility is still in question. Therefore, a novel thermo-sensitive polymeric material with good biocompatibility is required to develop even maintaining or overcoming the clear thermo-sensitivity of the conventional PNIPAAm.

From this point of view, a careful interest could be taken in poly(2-oxazoline) (POx). POx becomes hydrophilic when the 2-sustituent is a shorter alkyl group like methyl or ethyl, but hydrophobic when it is a longer or bulky alkyl and aryl groups. In particular, it should be noted that poly(2-isopropyl-2-oxazoline) (PiPrOx) in water also presents a lower critical solution temperature (LCST) under physiological conditions even around the human body temperature, as revealed by turbidity studies.[2] The repeat unit of PiPrOx is isomeric to that of PNIPAAm. However, the unique phase separation property of PiPrOx has not been studied in detail though it was found that PiPrOx exhibits sharp thermo-sensitivity comparable to that of PNIPAAm. Furthermore, while the synthetic methodology and polymerization mechanism of versatile POx derivatives including derived copolymers have been extensively investigated, there have been little studies on the solution properties of POx oligomers. The main reason of the deficient study on this issue is considered deriving from the failure in controlled synthesis of primary structures of POx polymers. The polymerization of 2-oxazolines proceeds usually in living nature, but at the same time often undergoes the remarkable side reactions such as chain transfer reaction occurring spontaneously among the reactive sites and 2-oxazoline monomers. These types of side reactions inevitably result in the defective polymer backbone structures involving wide molecular weight distributions, so that limit the further precise architecture of nanostructures such as polymeric micelles and demotivate the detailed study on their solution properties.

Based on these backgrounds, it was highly inspired to develop a novel thermo-sensitive polymeric micelle through the well-defined synthesis of narrow-disperse PiPrOx. Most of all, it should be elucidated where the side reactions are derived from and which is the best way to solve these undesirable synthetic problems, through the fundamental investigation on the aspect of polymerization mechanism of PiPrOx. This work is worth a lot to progress the study on their LCST phenomenon as well as the future application with them. Furthermore, the design of thermo-sensitive polyion complex (PIC) micelles, able to carry charged compounds including enzyme and DNA become even more attractive as an intelligent vehicle utilizing temperature changes as a physical affinity control.

In the present study, the molecular design of functional materials including controlled synthesis of novel thermo-sensitive poly(2-oxazolines) for the application to a smart drug delivery system with thermo-sensitivity in biomedical fields are described, mainly based on the strategy as shown in Figure. This thesis including general introduction (Chapter 1) and summary (Chapter 5) is composed of the five sections. Chapter 2 describes versatile well-defined synthesis of end-functionalized thermo-sensitive poly(2-isopropyl-2-oxazolines), Chapter 3 describes preparation and characterization of polyion complex micelles with novel thermo-sensitive poly(2-isopropyl-2-oxazoline) (PiPrOx) shell via the complexation of oppositely-charged block ionomers, and Chapter 4 describes precise control of lower critical solution temperature of thermo-sensitive poly(2-isopropyl-2-oxazoline) (PiPrOx) via gradient copolymerization with either 2-ethyl-2-oxazoline (EtOx) as a hydrophilic comonomer or 2-n-propyl-2-oxazoline (nPrOx) as a hydrophobic comonomer. Thus, the stability of thermo-sensitive PIC micelles was expected to increase with the introduction of more hydrophilic segments on outer corona, and what is more, their LCST variation attainable over a wide range of temperature as in the case of POx primary structures.

Through this thesis, a novel way to prepare very precisely temperature-sensitive polymeric materials beyond the well-known conventional poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) has been opened up and their possibility as a smart drug carrier in the biomedical fields was evaluated through the formation of thermo-sensitive PIC micelles among synthetic block ionomers.

Figure. The schematic strategy of thermo-sensitive polyion complex (PIC) micelles for therapeutics.

　近年の高分子合成科学の進歩は目覚しく、とりわけ、バイオ関連分野との接点で用いられる新しい機能性高分子材料の創出に対しての大きな貢献が期待されている。この時、重要となるのが種々リビング重合法の開発であり、一般的にリビング性を示す高分子反応は、分子量、分子量分布ともに制御された重合体を与えることから、精密な分子設計が望まれる構造体の構築には必要不可欠なものである。これまでは、その様なバイオ関連機能性高分子として、両親媒性かつ生体適合性に優れたポリエチレングリコル(PEG)誘導体の合成と末端への種々官能基の導入などの研究が代表的な例であるが、申請者は、低毒性かつ両親媒性ポリオキサゾリン(POx)誘導体に着目し、これらの精密合成法の確立による新規機能性高分子材料の開発を目的とした。特に、オキサゾリンの2位がイソプロピル基に置換されたモノマー(2-イソプロピル-2-オキサゾリン)(iPrOx)から得られる高分子は、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド) (PNIPAM)と同様に、生理的条件付近に下限臨界共溶温度(LCST)を有する温度応答性高分子であることに着目し、新たに、両末端に異なる官能基が導入できる末端反応性ポリ(2-イソプロピル-2-オキサゾリン)(PiPrOx)の精密合成ルートの確立を目指した。申請者はこのような研究の背景に基づいて、種々末端官能基を有する温度応答性PiPrOxの精密合成のみならず、外部温度に敏感に応答するポリイオンコンプレックス(PIC)ミセルを設計・調製して、その特性解析から得られた実験結果をもって、医・工学的な分野への応用を視野に入れて検討した内容を本学位請求論文としてまとめている。

　第1章は序論である。ここでは、従来のPEG表層を有する高分子ミセル形ドラッグデリバリシステム(DDS)の一般的な特徴とその有用性に触れるとともに、更なる機能性を付与したDDS構築のための新規温度応答性高分子材料の必要性とそのインテリジェントDDSへの展開可能性を中心に、本研究の意義及び論点を明確に繰り広げている。

　第2章では、両末端に異種官能基が導入された温度応答性PiPrOxの精密合成ルートの確立について詳細に検討している。一般的にPiPrOxは、リビングカチオン重合機構に従うものと知られているが、定量的な重合条件が確立されていなく、かつ、異種両末端官能基の導入に成功した報告例もない状態であった。そこで、申請者は、重合条件の徹底的な検討を通じ、副反応発生機構が重合温度と深く関係していることを見出した。詳しくは、低温条件(約40 ℃)下では分子量分布の非常に狭い(Mw/Mn 〓 1.03)重合体が得られ、α末端にはアセタル基、プロパルギル基、かつ、ω末端には水酸基、アクリレート基、チオール基、一級アミノ基などの様々な官能基が定量的に導入できることを実証した。また、得られたPiPrOx誘導体の温度応答挙動を濁度測定により評価し、生理的条件近傍にLCSTが存在することやポリマーの分子量の厳密な制御によるLCSTのコントロールも可能であることを結論づけている。

　第3章では、温度応答性高分子ミセル型DDSへの展開を目指し、申請者は、片末端に一級アミノ基を有するPiPrOxをマクロイニシエーターとして用い、2種類のα-アミノ酸N-カルボキシル無水物(BLA-NCA, Lys(Z)-NCA)のアニオン開環重合から、ブロックイオノマーの合成を行った。その結果、反対荷電を持つ2種類のブロックイオノマーが、狭い分子量分布(Mw/Mn 〓 1.2)を示しながら定量的に得られていることが確認された。このことから、一級アミノ基を有するPiPrOxは、NCAを効率的に重合させることが確認され、DNAや酵素などの荷電性生体分子とのPICミセルが形成できれば、外部温度に応答し特定細胞との疎水性相互作用が誘発でき、かつ、体内に直接遺伝子を導入するin vivo遺伝子治療を目指した高分子ミセル型遺伝子ベクターへの展開が期待された。申請者は、その予備実験として反対荷電を持つ2種類のブロックイオノマー同士のPICミセルを形成し、そのミセルの生理的条件下における安定性や温度応答挙動などの物性評価を詳細に検討している。併せて、ミセル表層のように高分子鎖の局所濃度が著しく高い環境下でのPiPrOxの応答温度(T(cp))は、試料溶液調製時の濃度に依存せず、ほぼ一定な値(約32 ℃)を示すことが明らかとなった。温熱療法などに有用な温度応答性DDSキャリアーとしての応用を考えると、PICミセルのT(cp)が広範な濃度変化に依存せずほぼ一定であることは非常にメリットである。なお、それぞれのブロックイオノマーが単独では全くT(cp)を示さないことから、温度応答性DDSキャリアーとしての目的を達成した後、解離されたフリーのブロックイオノマーが体内に長期間蓄積されることなしに、排出されやすい可能性も示唆された。

　第3章で検討した温度応答性PICミセルの物性評価のデータをもとに、荷電性ブロックイオノマーとプラスミドDNA(アニオン性)あるいはlysozyme(カチオン性)とのPICミセルの形成をそれぞれ試みたが、何れの系でも安定なミセルの形成は達成できなかった。その理由としては、ポリアミノ酸セグメントの長さ(DP = 50, 80)に対するPiPrOxの鎖長(DP = 45)が、安定なミセルを形成するには十分ではなかったことが上げられた。また、PICミセルのT(cp)が約32 ℃付近という割と低い値を示したのも、人体中DDSキャリアーとしての応用を考えると改善しなければならないところであった。そこで第4章で、申請者は、温度応答性ポリマーの一次構造におけるモノマー反復単位の親・疎水性のバリエーションがLCSTの制御とも深く関係していることに着目し、iPrOxと親・疎水性の異なる各種2-オキサゾリン(コモノマー)を様々な割合で混合させ、単分散なPOx共重合体を合成することにより、PiPrOx のLCSTを精密、かつ、広範(約25〜70 ℃)に制御したシステムの構築に成功している。

　以上のように機能性高分子材料の新規合成法の確立を出発点として、高感度に制御可能な高分子温度計や表示デバイスなどの工学的な応用への展開のみならず、遺伝子治療などのインテリジェントDDSへと多義に渡った展開が期待できる医用高分子材料の創出に向け、申請者は、種々末端反応性POx誘導体の精密重合から温度応答性PICミセルの安定な形成を通じて、材料の優れた機能を決定付ける最大の要因が精密な材料設計とそれを実現できる確かな合成ルートの確立にあることを見出した。本論文の内容は、その独創的なアプローチや得られた成果の高い有用性から考えて、医・工学の分野において極めて秀逸であると判定される。よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。