[Introduction]

　Cephalosporin antibiotics are one of the most important groups of antibiotics. They have a cephem nucleus with various side chains at the 3- and 7- positions of the β-lactam and dihydrothiaizine ring, respectively, and are classified into four generations based on their general features of antimicrobial activities. Most cephalosporins are excreted into the urine in unchanged form, while a few cephalosporins, such as cefoperazone, cefpiramide and cefodizime are excreted predominantly into the bile. According to the population pharmacokinetic analysis, it was found that the renal clearance of ceftizoxime exhibited a bimodal distribution due to an unknown mechanism. Genetic factors have been hypothesized to account for this bimodal distribution.

　The urinary excretion of drugs and their metabolites consists of glomerular filtration and tubular secretion. Tubular secretion of drugs has been characterized by organic anion and cation transport systems. Cephalosporins are known to be substrates of basolateral organic anion transporters (OAT1 and OAT3). Since OAT3 exhibits greater transport activity than OAT1, OAT3 has been considered to play a major role in the renal uptake process. There are a few single nucleotide polymorphisms affecting the functional activity of OAT1 and OAT3, however, their allele frequencies are too rare to account for the bimodal distribution. Therefore, the present study focused on the subsequent efflux process, particularly focusing on multidrug resistance-associated protein 4 (MRP4/ABCC4), a member of the ABCC family which expressed in the brush border membrane of the proximal tubules in the kidney. This study investigated whether MRP4 is involved in the tubular secretion of cephalosporins, and whether the polymorphisms of MRP4 relate to the various pharmacokinetic parameters of cephalosporins.

[Methods and Results]

1. Transport of cephalosporins by MRP4

　Human MRP4 and mouse Mrp4 were expressed in an HEK 293 cell line using adenovirus expression systems. The effect of various cephalosporins on the ATP-dependent uptake of [3H] dehydroepiandrosterone sulfate by MRP4-expressing membrane vesicles was examined. The results showed that most of the cephalosporins are inhibitors of MRP4, and injected cephalosporins were more potent inhibitors than oral ones with the exception of cefepime, cefsulodin and cefaloridin, which showed no effect on MRP4 mediated transport of [3H]DHEAS. The ATP-dependent transport of cephalosporins by MRP4 was examined in the vesicular study. Time- and ATP-dependent transport of ceftizoxime, cefazolin, cefotaxime and cefmetazole were observed (Fig 2). The Km and V(max) values for the ATP-dependent uptake of ceftizoxime by MRP4 were 18.3 ± 2.2 mM, and 529 ± 26 pmol/min/mg protein and, for cefazolin, the corresponding parameters were 80.9 ± 10.9 mM and 3.24 ± 0.25 nmol/min/mg protein.

2. Renal excretion of ceftizoxime, cefazolin in Mrp4 (-/-) and wild-type mice

　An in vivo study using Mrp4 knockout mice was carried out to determine the renal clearance of ceftizoxime and cefazolin between the wild-type and Mrp4 knockout mice (Fig 3). The plasma concentrations after intravenous infusion of ceftizoxime were similar in Mrp4 (-/-) mice and wild-type mice, while they were slightly higher in Mrp4 (-/-) mice than wild-type mice for cefazolin. The urinary excretion of ceftizoxime was significantly reduced in Mrp4 (-/-) mice compared with wild-type mice, while there was no significant difference in the urinary excretion rate and the total clearance of cefazolin between Mrp4 (-/-) mice and wild-type mice. The kidney accumulation of ceftizoxime and cefazolin was significantly higher in Mrp4 (-/-) mice than wild type mice (1.9- and 3.4-fold, respectively), while the renal clearance with regard to the kidney concentration were reduced in Mrp4 (-/-) mice (51 and 37% of the control, respectively). The in vivo results indicate that Mrp4 makes a significant contribution to the tubular secretion of cephalosporins.

3. Functional analysis of SNPs variants of MRP4

　Four single nucleotide polymorphisms (SNPs) of MRP4 encoding for amino acid changes (G171C, G187W, K304N and E757K) were generated using site-directed mutagenesis, the expression levels and transport activities were determined using the membrane vesicles from HEK 293 cells infected with the recombinant adenoviruses containing cDNA of the MRP4 variants. All variants exhibited lower protein expression, particularly the expression level of G171C was 50% of the control. Transport activity of ceftizxime by MRP4 was lower in G171C MRP4 variant (〜50%) than those in other variants due to lower protein expression, while K304N and E757K MRP4 variants exhibit greater transport activities of dehydroepiandrosterone sulfate (140% of wild-type). For p-aminohippurate, G187W MRP4 variant exhibited greater transport activity (140%). These results suggest that the effect of SNPs is substrate-dependent, and G187W variation is associated with decreased renal clearance of ceftizoxime due to lower protein expression level.

4. Uptake of ceftizoxime by kidney slices

　The renal uptake of ceftizoxime was investigated using kidney slices. Saturable uptake of ceftizoxime was observed in kidney slices with a Km value of 3.78 ± 0.95 mM. The inhibitory effect of substrates of OATs, such as PAH and benzylpenicillin, and a non-specific inhibitor of organic anion transporters, probenecid, on the uptake of ceftizoxime by kidney slices was examined. The inhibitory effect of p-aminohippurate and benzylpenicillin was lower than that of probenecid, sufficient to saturate their own uptake. Namely, it is likely that other transporters distinct from OAT1 and OAT3 are responsible for the uptake of ceftizoxime.

[Conclusion and discussion]

　The present study suggests that some cephalosporins are substrates of MRP4, and it accounts for the luminal efflux of ceftizoxime and cefazolin together with an unknown transporter. The effect of SNPs of MRP4 is likely to be substrate dependent. G187W is expected with decreased renal clearance of ceftizoxime due to lower protein expression level. An uptake study using kidney slices suggests the involvement of an unknown transporter in the renal uptake process. Genetic factors of this transporter may account for the bimodal distribution.

[Acknowledgement]

　I would like to thank Drs. Schuetz and Adachi for providing Mrp4 knockout mice.

Fig. 1 The mechanism of renal excretion

Fig. 2 Time-profiles of the uptake of various cephalosporins by human MRP4-expressing vesicles.

Fig. 3 Time profiles of the plasma concentration, urinary excretion and kidney concentration of ceftizoxime, cefazolin in Mrp4 (-/-) and wild-type mice.

(A) Ceftizoxime

(B) Cefazolin

　セファロスポリン系抗生物質はβ-ラクタム系抗生物質に属し、セファマイシン類やオキサセフェム類と共にセフェム系抗生物質と総称される。セファロスポリン系抗生物質はベータラクタム環(四員環ラクタム)とヘテロ六員環を持ち、これまでにベータラクタム環の3位とヘテロ六員環の7位のそれぞれに種々側鎖を持つ多様なセファロスポリン系抗生物質が開発されてきた。セファロスポリン系抗生物質はグラム陰性菌・陽性菌に対する抗菌作用を示し、抗菌スペクトルによって第一世代〜第四世代セフェムに分類される。ほとんどのセファロスポリン抗生物質の生体内からの排泄経路は尿排泄であるが、cefoperazone, cefpiramideやcefodizimeのように一部のセファロスポリン抗生物質は主に肝臓から排泄される。従来からの解析により、これらセファロスポリン抗生物質の生体内運命の決定には、トランスポーターが深く関与していることが明らかにされてきた。

　本研究で取り上げたceftizoximeは腎排泄が主な排泄経路であり、糸球体濾過の他に近位尿細管において尿細管分泌を受けることが知られている。興味深いことに、72人の患者におけるceftizoximeの体内動態について母集団薬物動態学解析が行われた結果、ceftizoximeの腎クリアランスは二峰性分布が存在し、排泄能力の低い患者が全体の37%という高い割合で存在することが報告されている。一般に、医薬品の尿細管分泌にはトランスポーターが関与することから、ceftizoximeの腎排泄に関わるトランスポーターに高頻度で個人間変動が存在することが予想される。腎尿細管上皮細胞側底膜におけるセファロスポリン系抗生物質の取り込み過程には、有機アニオントランスポーター(OAT1とOAT3)が関与していることが示唆されている。OAT1とOAT3機能に影響を与える一塩基多型(single nucleoitde polymorphism, SNP)が存在することは知られているが、そのアリル頻度は非常に低く、取り込み過程における個人間変動では二峰性分布を説明することは難しい。本研究では、ceftizoximeの腎クリアランスが二峰性分布を示すメカニズムを明らかにするために、ceftizoximeの腎排泄に関わるトランスポーターの同定(第1章)とコーディング領域のおける一塩基多型(single nucleoitde polymorphism, SNP)の解析(第2章)が行われた。本研究で取り上げられたABCトランスポーターであるmultidrug resistance associated protein 4 (MRP4)は広範な基質選択性を示し、cGMP, cAMP等のcyclic nucleotides、ステロイドの抱合体等内因性物質を基質とする他、種々薬物を基質とすることが明らかにされている。腎臓では近位尿細管の刷子縁膜に発現し、腎臓中から尿細管管腔中への排出に働いていることが示唆されているトランスポーターである。更に、第三章ではラットの腎スライスを用いて、ceftizoximeの腎尿細管上皮細胞の側底膜取り込み過程について研究が行われた。OAT1とOAT3以外に、ほかのトランスポーターはceftizoximeの側底膜取り込みに関与していることが示唆された。

1　セファロスポリンの尿細管分泌におけるMRP4の関与

　Human MRP4とmouse Mrp4のcDNAを組み込んだ組み替えアデノウィルスを調製し、HEK293細胞を宿主細胞として過剰発現系を構築した。ウィルス感染細胞から調製した細胞膜ベシクルでは、MRP4の典型的な基質であるdehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS)のATP依存的な取り込みが確認されている。注射剤であるセファロスポリン系抗生物質は、cefepime、cefsulodinとcefaloridinを除き、hMRP4機能を強く阻害した。Cefalexin、cefaclor、cefadroxilなど経口剤として用いられるセファロスポリン系抗生物質の阻害能は低いことが明らかになった。更に、ceftizoxime、cefazolin、cefotaximeとcefmetazoleについては、MRP4を強制発現させた膜ベシクルでのみATP依存的な輸送が観察され、これらのセファロスポリン系抗生物質がMRP4の基質となることが明らかとなった。Ceftizoximeについては、mMrp4の基質になることも確認されている。

　MRP4の基質となるセファロスポリン系抗生物質のうち、ceftizoximeとcefazolinをマウスに定速静注し、定常状態における薬物の血液・腎臓中濃度、尿中排泄速度を測定し、全身クリアランス、腎クリアランスなど速度論パラメーターを求めた。両化合物ともに、腎クリアランスは糸球体濾過速度よりも大きく、尿細管分泌を受けることが示された。更に、MRP4の関与を明らかにするために、野生型マウスとMrp4 knockoutマウスとで速度論パラメーターが比較された。Ceftizoximeとcefazolinともに定常状態の血中濃度には有意な差が見られなかった。CeftizoximeではMrp4 knockoutマウスにおける尿中排泄速度に有意な減少が認められたが、cefazolinでは有意な差は認められなかった。血液中濃度基準の全身クリアランスと腎クリアランスには、有意な差は認められなかった。しかし、ceftizoximeとcefazolinの腎臓中濃度はMrp4 knockoutマウスにおいて1.9倍と3.4倍に増加しており、Mrp4 knockoutマウスにおける腎臓中濃度基準の腎排出固有クリアランスは野生型マウスの7.5と34%に減少したことになる。この結果はMrp4がセファロスポリン系抗生物質の尿細管分泌に関与している事を示唆している。

2　MRP4の遺伝子多型の解析

　MRP4の遺伝子多型のうち、コーディング領域上に存在し、かつアミノ酸置換を伴う4つのSNPs (G171C, G187W, K304N, E757K)に注目し解析が行われた。これらのSNPsを持つ変異体MRP4 cDNAを組み込んだ組み換えアデノウィルスを調製し、HEK293細胞を宿主細胞として遺伝子発現系を構築した。細胞膜上のMRP4発現量に関しては、4つの変異体はwild typeよりも低くなる傾向を示し、とくにG187Wでは野生型の50%に低下していた。輸送能力に関しては、ceftizoximeについてはG187Wでは野生型の50%であり、DHEASについてはK304NとE757Kが野生型の140%、PAHについてはG171Cで野生型の140%であった。この結果から、MRP4の遺伝子多型は基質依存的に影響が異なることが示唆された。G187Wによるceftizoximeの輸送能力の低下は発現量の低下で説明される。このSNPはceftizoximeの腎排泄の低下に繋がる可能性を有しているが、現在文献的に報告されているアリル頻度からすると、この遺伝子多型のみでceftizoximeの腎クリアランスの二峰性分布説明することは困難である。

3　腎スライスによりceftizoximeの取り込みの評価

　腎スライスを用いて、ceftizoximeの腎取り込み過程に関わるトランスポーターについて研究が行われた。Ceftizoximeの腎スライスへの取り込みは飽和性を示し、トランスポーターによる膜透過が大部分を説明できることを明らかとなった。OAT1とOAT3選択的阻害剤であるp-aminohippurateとbenzylpenicillin、有機アニオントランスポーターの非特異的な阻害剤であるprobenecidを使って、ceftizoximeの取り込みに対する阻害作用を検討したところ、p-aminohippurateとbenzylpenicillinではほとんど阻害が見られず、またprobenecidの阻害作用もOAT1とOAT3に対するものよりも弱いことが明らかになった。この結果は、従来の仮説とは異なり、OAT1とOAT3とは別のトランスポーターがceftizoximeの側底膜取り込みに関与していることを示唆している。このトランスポーター機能の個人間変動が、ceftizoximeの腎クリアランスの二峰性分布を説明するという可能性も考えられる。

　本研究では、in vitroでの輸送実験ならびに、Mrp4 knockoutマウスを用いたin vivo体内動態解析により、一部のセファロスポリン系抗生物質の腎排泄にMRP4が関与していることを明らかにした。MRP4の遺伝子多型解析(SNPs)により、コーディング領域の遺伝子多型がMRP4機能(発現量、輸送活性)に与える影響を明らかにした。また、腎の取り込み過程に、OAT1とOAT3とは異なる有機アニオントランスポーターが発現し、ceftizoximeの取り込みに関与している事を明らかにした。これらの結果は、薬物の生体内運命を制御し、適切な動態特性を有する医薬品の開発に貢献するとともに、ファーマコジェノミクスに基づいたテーラーメード医療への応用が期待される。本研究を、博士(薬学)の学位を授与するに値するものと認めた。