Gibberellic Acid (GA) is involved in various aspects of plant developmental programs such as seed germination, stem elongation, leaf expansion, floral induction. Therefore both the biosynthesis and the signal transduction of GA should be under rigid controls. Recently, almost all the enzymes participating in GA biosynthesis have been identified in Arabidopsis thaliana, and molecular genetic approaches have unraveled several components responsible for GA signal transduction including a soluble GA receptor, GID1. In spite of these progresses, however, the relation between the GA biosynthesis and the GA signal transduction still remains elusive. One of interesting phenomenon is GA-negative feedback regulation of the genes encoding GA biosynthetic enzymes. Namely, increase in endogenous GA levels represses these genes, and decrease in endogenous GA levels activates them. Thus it is hypothesized that the biosynthesis of GA is regulated by GA signal transduction in response to the amount of endogenous GA. Furthermore, it is indicated that plants maintain the homeostasis of endogenous GA through the feedback. In this study, I tried to reveal the molecular mechanism underlying GA-negative feedback regulation.

Based on the analysis of several plant species, the genes regulated by GA-negative feedback are those of GA 20-oxidases and GA 3 oxidases. Because GA 3-oxidase catalyzes the last step to generate active GAs, GA-negative feedback regulation of GA 3-oxidase gene seemed relatively more important than that of GA 20-oxidase. In Arabidopsis genome, there are at least four genes encoding GA 3-oxidase, AtGA3ox1-4. Among them, AtGA3ox1 and 2 had been investigated about their GA-negative feedback regulation, and it had been shown that the expression of AtGA3ox1 is under GA-negative feedback but that of AtGA3ox2 are not. To determine whether other AtGA3oxes are under GA-negative feedback regulation, I performed RT-PCR DNA gel blot analysis. In results, neither AtGA3ox3 nor 4 were not under GA-negative feedback, thus only AtGA3ox1 is under GA-negative feedback. Moreover, although AtGA3ox2, 3 and 4 showed organ specific expression pattern, AtGA3ox1 was expressed ubiquitously and highly in every organ examined. In view of GA-negative feedback regulation and the expression pattern, it was suggested that AtGA3ox1 is a major GA 3-oxidase gene in Arabidopsis.

Since GA-negative feedback regulation seemedr4 transcriptional regulation, it was suggested that AtGA3ox1 promoter region contains cis-elements necessary for GA-negative feedback. To identify the cis-elements, we generated several 5'-deleted variants of AtGA3ox1 promoter. These promoter regions were transcriptionally fused to a reporter gene of β-glucronidase, and introduced into Arabidopsis for stable transformation. Transformants obtained were subjected to the treatment with GA or GA biosynthetic inhibitor uniconazole P, and GUS activity was measured. In result, although both -2008 bp and -1016 bp promoter regions from translation initiation site showed GA-negative feedback response in GUS activity, deletion of 208 bp from -1016 bp to -809 bp abolished GA-negative feedback. Consistently, five tandem copies of the 208-bp DNA fragment endowed the reporter with a remarkable property of GA-negative feedback regulation by GA, suggesting that the sequences are sufficient for GA-negative feedback. To further define cis-elements for GA-negative feedback of AtGA3ox1 promoter, 5' deletion analysis of the 208-bp sequence between -1016 bp and -809 bp was performed. Deletion of 56 bp from -1016 bp to -961 bp resulted in a loss of feedback regulation by GA. Furthermore, addition of 43-bp sequence between -1003 bp to -961 bp into -918 bp, which did not show GA-negative feedback response by itself, recovered the GA-negative feedback. These results substantiate the importance of the 43-bp sequence in feedback regulation of GA. In summary, my results show that the 208-bp sequence between -1016 bp and -809 bp is sufficient for GA-negative feedback, and that the 43-bp sequence from -1003 bp to -961 bp is indispensable. I named the 43-bp sequence GNFEI (for GA-negative feedback element I) and focused on the trans-acting factor that binds to it.

Next, I proceeded to isolate trans-factor(s) which binds to GNFEI and regulates the expression of AtGA3ox1. By using 3 × GNFEI, yeast one hybrid screening was performed. In result, about 3 × 106 colony yielded several positive clones. Sequence analysis revealed that they encode proteins containing AT-Hook. Thus, I named these proteins AGF1 and 2 (for AT-Hook protein for GA-negative Feedback). AGF1 and 2 are member of a gene family consisting of 30 genes, and characterized by DNA-binding motif AT-Hook and function unknown PPC (plants and prokaryotes conserved) domain. I chose AGF1 for further analysis. For confirmation, I performed gel mobility shift assay and detected the binding of AGF1 to GNFEI. In addition, nucleotide substitution into specific AAAT repeat sequences in GNFEI abolished the binding of AGF1 to GNFEI. Therefore, AGF1 binds to GNFEI through the repeat sequence at least in vitro. Furthermore, I demonstrated that GUS gene fused with -1016 bp promoter region of AtGA3ox1 with mutation in the AGF1 binding repeat sequences could not respond to GA in vivo. These results strongly suggested that AGF1 binds to GNFEI in vivo, and involved in GA-negative feedback.

If AGF1 is involved in GA-negative feedback, function of AGF1 might be regulated by GA. To know how GA controls AGF1, we investigated whether the expression and the intracellular localization of AGF1 is affected by GA. RT-PCR DNA gel blot revealed that gene expression of AGF1 is not regulated transcriptionally by GA. Microscopic analysis of transgenic Arabidopsis expressing AGF1-GFP fusion protein showed that AGF1 is located in nucleus but its localization and amount were not influenced by GA. These observations indicated that functional regulation of AGF1 by GA does not depend on transcriptional control and intracellular localization, rather depend on other mechanisms including covalent modification and protein-protein interaction. Finally, to determine whether AGF1 could affect the expression of endogenous AtGA3ox1 in vivo, we generated AGF1 constitutive expressor transformant. Compared to wild type, the expression of AtGA3ox1 in AGF1 constitutive expressor was not affected in normal growth condition; however, it showed hyper sensitive to decrease of GA levels. Consistently, in AGF1 constitutive expressor, the expression of AtGA3ox1 was more resistant to the repression by application of GA than wild type. Thus we propose that AGF1 is a transcriptional activator, specific to GA-negative feedback.

Here in this study, I found AGF1, a transcriptional activator involved in GA-negative feedback regulation of AtGA3ox1. To identify additional factors which bind and/or modify AGF1 will lead to understanding of the mechanism underlying GA-negative feedback. Moreover, such analysis of GA-negative feedback will pave the way to the comprehensive picture of GA action and GA homeostasis.

　本論文は、植物ホルモンの一つジベレリン(GA)内生量の恒常性維持のメカニズムに関して、分子生物学的、植物生理学的に解析したものであり、5章からなる。第1章では、Prefaceとして、この研究の背景と研究を始めるにあたっての動機を述べている。第2章では本研究で使われた材料と方法について記述されている。第3、4章は研究の結果とその考察であり、第3章では、GA生合成の最終反応を触媒するGA3-酸化酵素をコードするAtGA3ox遺伝子群の発現パターンの解析と、AtGA3ox1遺伝子のGAフィードバック制御に関するシス配列の解析について記述されている。第4章では、前章で同定したGAフィードバック制御に関するシス配列に結合する転写因子AGF1の同定とその機能解析について記述されている。第5章では得られた結果を受けて、総合的にGAフィードバック制御の生理学的意義について考察している。

　植物はGA内生量を一定の範囲内に保つ機構を有している。GA3-酸化酵素遺伝子の転写レベルでのフィードバック制御は、その中心的なメカニズムの一つと考えられる。論文提出者は、GA3-酸化酵素遺伝子AtGA3ox1のフィードバック制御の分子機構を解明するために、シス配列と転写因子の同定とその機能解析を行った。

　論文提出者は、まず、シロイヌナズナの全てのGA3-酸化酵素遺伝子AtGA3ox1-4の発現パターンの解析を行った。その結果、フィードバック制御を受けるのはAtGA3ox1のみであり、他の遺伝子の発現はGA内生量変化に影響されないことが明らかになった。またAtGA3ox1は他の遺伝子に比べ、恒常的、かつ高い発現量を示した。よってフィードバック制御、発現量の2つの点から見て、シロイヌナズナにおける主要なGA3-酸化酵素遺伝子xはAtGA3ox1であると結論し、以降の転写制御解析の対象とした。

　AtGA3ox1のフィードバック制御に関するシス配列を同定するため、様々な長さの5'欠損AtGA3ox1プロモーターをレポーター遺伝子の上流に挿入し、シロイヌナズナに導入した。得られた形質転換植物を用いて解析した結果、AtGA3ox1の翻訳開始点から上流808bp-1016bpの間にフィードバック制御に必要なシス領域が含まれていると推定された。そこでこの約200bpの領域だけを複数連結させると、最小プロモーターに非常に強いフィードバック応答性を付与した。この領域に関してさらに詳細な解析を行ったところ、AtGA3ox1プロモーター上の961bp-1003bpまでの配列がフィードバック応答には必須であることが明らかとなった。このシス領域をGNFE I (GA Negative Feedback Element I)と命名した。これらの成果はGAフィードバック応答を制御するシス配列に関する初の研究として高く評価された。

　次に、論文提出者は、GNFE Iに直接結合して、AtGA3ox1の転写を制御する因子の単離を行った。酵母one-hybrid法によりシロイヌナズナcDNAライブラリをスクリーニングした結果、複数のAT-hookモチーフを持つクローンが得られた。これらをAGF1 (AT-hook protein of GA feedback regulation)及びAGF2と命名した。AGF1、2はいずれもDNA結合ドメインであるAT-hookモチーフと機能未知のPPCドメインを有しており、シロイヌナズナ内で30の遺伝子からなるファミリーを形成している。AGF1とGNFE Iの結合はゲルシフト法によりin vitroにおいても確認された。またGNFE I内の特定の塩基に変異を導入するとAGF1との結合が消失した。更にAGF1結合配列位に変異を導入した上流1016bpまでのプロモーターをGUSに結合した融合遺伝子は、形質転換植物体においてフィードバック応答を消失していた。従ってこれらの結果からAGF1はin vivoにおいてもGNFE Iに結合しフィードバック制御に関与していると推定された。

　さらに、論文提出者はAGF1の植物体における機能を解析するためにAGF1を過剰発現する形質転換体を作製し、AtGA3ox1発現への影響を解析した。その結果、AGF1過剰発現体では、GA欠乏状態でのAtGA3ox1の発現量上昇が野生株に比べ促進され、さらにGA投与によるAtGA3ox1の発現量減少が抑制されることが明らかになった。すなわちAGF1はGAフィードバック制御におけるAtGA3ox1の転写活性化因子であることが示された。この成果はAtGA3ox1のGAフィードバック制御に関与する転写因子を同定した世界初の研究として高く評価された。

　なお、本論文は古本強(広島大学理学研究科)、石田さらみ(東京大学理学系研究科)、高橋陽介(広島大学理学研究科)との共同研究であるが、論文提出者が主体となって実験を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

　以上、ここに得られた結果の多くは新知見であり、いずれもこの分野の研究の進展に重要な示唆を与えるものであり、かつ本人が自立して研究活動を行うのに十分な高度の研究能力と学識を有することを示すものである。よって、松下茜提出の論文は博士(理学)の学位論文として合格と認める。