Eukaryotic small ribosomal subunit (SSU) synthesis involves eight major nonribosomal proteins, Dim2p, Rrp12p, Tsr1p, Enp1p, Hrr25p, Nob1p, Dim1p, and Rio2p, as well as SSU proteins and rRNAs. As a core constituent of SSU RRP complex (SSU ribosomal RNA processing factor complex), Dim2p in yeast follows the preribosomes from early nucleolar to late cytoplasmic stages and is required for the cleavage at processing sites A1 and A2 to generate the pre-20S rRNA. [1] Dim2p homologues have been found in archaea as well as in eukarya but not in eubacteria. Little is known about the exact processing and release mechanisms of eukaryotic Dim2p and other processing factors from 40S ribosomal subunit during 18S rRNA maturation thus far.

　Recently the translational initiation in archaea has attracted more attention because of its remarkable similarity to that in eukaryotes but much simpler. [2] In archaea, there are about ten homologues to eukaryotic initiation factors.[3] Archaea seem to have two different translational initiation mechanisms: 5' leaderless mRNA translation and Internal SD sequence dependent translation. [4] In this study, in order to study the roles of archaeal Dim2p and eIF2 (especially eIF2alpha) in the SSU synthesis process and translational initiation and the transition of these two sequent processes in archaea, Dim2p and Rio2p and eIF2alpha from Pyrococcus horikoshii OT3 were selected as targets to study.

1. Crystal structure of Dim2p from Pyrococcus horikoshii OT3 (PH-Dim2p)

　Only one tertiary structure has been determined thus far for Dim2p-homologous proteins: the crystal structure of APE0754 from the aerobic hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix (PDB code 1TUA, Zhang et al., unpublished results). Here I determined the crystal structure of PH-Dim2p, the Dim2p from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT3, at 2.30 Å (Figure 1).[5,6]

　PH-Dim2p contains two KH domains: KH-1 (N-terminal) and KH-2 (C-terminal). The two KH domains are connected by a short linker, and the relative arrangements of the two KH domains are well-defined by a number of inter-domain interactions. The RNA-binding surfaces of KH-1 and KH-2, which are oriented in the same direction, involve many different amino acid residues.

2. Biological function studies of PH-Dim2p

　Dim2p in yeast (with one KH-domain) was known to be required for the cleavage at processing sites A1 and A2 to generate the pre-20S rRNA, so it is expected to have rRNA binding activity and recognize specific sequence with other processing factors. Furthermore, as a core constituent of SSU RRP complex, the yeast Dim2p involves several physical and biological interactions with other components, Rio2p, Tsr1p, Enp1p, Nob1p, and Dim1p. [1]

　We identified the homologue of Rio2p in Pyrococcus horikoshii OT3 (PH-Rio2p) and found that it physically interacts with PH-Dim2p. PH-Rio2p, as an RNA dependent protein kinase, phosphorylates the conserved phosphorylation site of eIF2alpha from Pyrococcus horikoshii OT3 (PH-eIF2alpha) in vitro. It was found that PH-Dim2p seems to regulate phosphorylase activity of PH-Rio2p in vitro. In addition, PH-eIF2α's phosphorylation depends upon the autophosphorylation of PH-Rio2p.

3. Crystal structure of Dim2p/eIF2α/rRNA complex from Pyrococcus horikoshii OT3

　In order to study the roles of archaeal Dim2p and eIF2 (as a/Dim2p and a/eIF2) in the SSU synthesis process and translational initiation and the transition of these two sequent processes in archaea, the X-ray crystal structure of the complex of eIF2alpha and Dim2p from Pyrococcus horikoshii OT3 (PH-eIF2alpha and PH-Dim2p) together with a 16S rRNA 3'-terminal fragment derived from E. coli (almost identical with the one of Pyrococcus horikoshii OT3) was determined at 2.8 Å (Figure 2).[7]

　The complex structure reveals that KH domain-1 and KH domain-2 of PH-Dim2p bind to a core anti-SD sequence (CCUCC) and a highly conserved rRNA sequence of target rRNA fragment respectively; the interaction between PH-eIF2alpha and PH-Dim2p is mainly electrostatic. The complex structure indicates that PH-Dim2p couples 16S rRNA's 3'-terminal maturation and translational initiation in Pyrococcus horikoshii OT3. Through aligning the structure of PH-eIF2alpha to those of eIF2alpha from Pyrococcus abyssi (PDB ID code 1YZ6) and eIF2alpha-gamma from Sulfolobus solfataricus (PDB ID code 2AHO), we propose that a/eIF2 triggers the release of a/Dim2p from 16S rRNA in stead of forming a stable complex together, because apparent structural changes exist around a/Dim2p-binding region of a/eIF2alpha. Furthermore, it is suggested that a/Dim2p involves in translational type regulation with a/eIF2 and a/eIF2's initial orientation on 30S subunit in archaea.

Figure 1. Overall structure of Dim2p from Pyrococcus horikoshii OT3

Figure 2. Overall structure of Dim2p/eIF2alpha /rRNA complex

　本論文では、超好熱性古細菌Pyrococcus horikoshii OT3由来のDim2pおよびDim2p/eIF2alpha/rRNA複合体のX線結晶構造解析を行い、古細菌の16SリボソームRNAの成熟と翻訳開始におけるDim2pとeIF2αの役割について述べている．本論文は第一章の序論、第五章の結論を含む全5章からなる。

　第一章では、これまでに知られているDim2pとeIF2alphaの機能が説明されている。また、Dim2pによるリボソームRNAのプロセッシングの機構が明らかにされていないことを説明し、リボソームRNAの成熟から翻訳開始までの過程が未知であることも説明している。そして、研究の目的が、古細菌の16SリボソームRNAの成熟と翻訳開始におけるDim2pとeIF2の役割を構造学的見地から解明することとしている。

　第二章の内容:古細菌P. horikoshii OT3由来の16SリボソームRNAの成熟に

関わる蛋白質Dim2p(PH-Dim2p)の結晶構造(分解能2.3Å)を決定した。PH-Dim2pが2つのKHドメインをもつことが確認され、ドメイン間に多くの相互作用が見られた。この相互作用がKHドメインの特徴的な空間配置を実現し、これによってKHドメインには正電荷に富んだ溝が形成されていた。既知のKHドメインとRNAの複合体の結晶構造を参考にして、PH-Dim2pとRNAの相互作用がこの正電荷に富んだ溝において起こることを予想した。

　第三章の内容:古細菌P. horikoshii OT3由来のDim2pの生化学的機能に関する実験と考察をおこなった。過去の報告から、Dim2pが直接16SリボソームRNA前駆体と相互作用すると考えられるが、in vitroの結合実験により、PH-Dim2pと16SリボソームRNAが実際に相互作用することが示された。また、酵母由来のDim2pとRio2p(タンパク質キナーゼ)は相互作用することが知られているが、同様にP. horikoshii OT3由来のDim2pとRio2p(PH-Dim2pとPH-Rio2p)の間にも相互作用があることが示された。具体的には、in vitroの実験により、PH-Dim2pがPH-Rio2pのリン酸化(基質はPH-eIF2alpha)と自己リン酸化を促進することを発見した。Rio2pは自己リン酸化(リン酸化部位は複数)によって活性型となり、eIF2alphaをリン酸化することがすでに知られていたが、PH-Rio2pの自己リン酸化部位のひとつであるSer138をAlaに置換することで、他の部位で起こる自己リン酸化能を阻害することなく、PH-eIF2aIphaをリン酸化する活性のみがなくなることを示した。これにより、PH-Rio2pがPH-eIF2alphaをリン酸化する活性にSer138が必須であることが示された。

　第四章の内容:古細菌Pyrococcus horikoshii OT3由来のDim2p/eIF2alpha/rRNA複合体の結晶構造(分解能2.8Å)を決定した。Dim2P/eIF2alpha/rRNA複合体の立体構造が報告されたのは世界で初めてである。結晶構造からDim2pが結合するssRNAの塩基配列が決定され、これによってDim2Pが16SリボソームRNAの3'末端に結合することが示された。また、PH-Dim2pの2つのKHドメインは認識・結合する塩基配列が全く異なり(KH-1ドメインはanti-SD配列に特異的に結合)、Dim2p全体で一つの配列特異性を実現していることも示された。この結果から、PH-Dim2pの役割が、特定の塩基配列の認識と3'末端の保護であることを提唱した。翻訳が開始されるためにはeIF2alphaがDim2pから解離する必要がある。構造既知のeIF2alpha/eIF2gamma複合体とDim2p/eIF2alpha/rRNA複合体の比較により、eIF2alpha解離のモデルを提唱した。すなわち、eIF2gammaがDim2p/eIF2alpha/rRNA複合体に含まれるeIF2alphaに結合することで、eIF2alphaのC末端ドメインとN末端ドメインの相対的な位置が変化し、eIF2alphaとPH-Dim2pの間の特異的な相互作用が弱まり、解離するというモデルである。このことから、16SリボソームRNAが成熟した後、Dim2pとeIF2が協同的にはたらき、翻訳開始の類型(leaderless mRNAの翻訳か、polycistronic mRNAの翻訳か)を選択することを提唱した。

　以上、本研究で得られた知見は、学術的に大いに貢献するところである。よって、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として十分な価値のあるものであると認めた。