Iron (Fe) is an essential element required for various cellular events in plants, including respiration, chlorophyll biosynthesis, and photosynthetic electron transport. Fe is also a component of the Fe-S cluster, which is present in numerous enzymes. Thus the acquisition of Fe from soil and its homeostasis is essential for normal plant growth. To understand the mechanisms of Fe acquisition and homeostasis, different genes involved in Fe-acquisition/homeostasis or Fe-deficiency induced stress tolerance were cloned from graminaceous plants. These include deoxymugineic acid synthase (DMAS) from rice (OsDMAS1), barley (HvDMAS1), wheat (TaDMAS1) and maize (ZmDMAS1) plants, glutathione reductase (GR) from barley (HvGR1 and HvGR2) and glutathione transporter like gene (OsGTL1). The expression patterns of these genes and their possible roles in Fe-acquisition as well as homeostasis were revealed.

1). Cloning and characterization of DMAS genes form graminaceous plants

　Graminaceous plants have evolved a unique mechanism to acquire Fe and secrete a family of small molecules, called mugineic acid family phytosiderophores (MAs) in response to Fe-deficiency. MAs are synthesized form L-methionine. Three molecules of S-adenosyl methionine are combined together to form one molecule of nicotianamine (NA). The amino group of NA is transferred by NA-amino transferase to form Keto form, which is subsequently reduced to deoxymugineic acid (DMA) by deoxymugineic acid synthase (DMAS). DMA is the first member of MAs and MAs share the same pathway from L methionine to DMA and the subsequent steps may differ depending upon the plant species and even cultivars. Previously all the genes cloning of DMAS, with the exception of DMAS, involved in MAs biosynthetic pathway have been cloned from rice and barley. DMAS was first isolated from rice (OsDMAS1) as a member of aldo-keto reductase super family (AKR) upregulated under Fe-deficiency and then its orthologs from barley (HvDMAS1), wheat (TaDMAS1), and maize (ZmDMAS1) were also cloned. Their nucleotide sequences indicate that OsDMAS1 encodes a predicted polypeptide of 318 amino acids, whereas the other three orthologs all encode predicted polypeptides of 314 amino acids and are highly homologous (82-97.5%) to each other. The DMAS genes belong to AKR and have homology to Papaver somniferum codeinone reductases (AKR4B2-3), and Medicago sativa (AKR4A2) and Glycine max (AKR4A1) chalcone polyketide reductases (Fig-1). Although strictly speaking it does not fall in to existing subfamilies of AKR4, however, after introduction of conservative substitutions, the identity with existing members of AKR4B reached up to 65% and ZmDMAS1, OsDMAS1, HvDMAS1 and TaDMAS1 were assigned the numbers from AKR4B5 to AKR4B8 respectively.　DMAS proteins were expressed in E. coli. as maltose binding fusion proteins and all the recombinant proteins showed DMA synthesis activity in vitro. Their enzymatic activities were highest at pH 8 to 9 (Fig-2), consistent with the hypothesis that DMA is synthesized in subcellular vesicles. Northern blot analysis revealed that the expression of each of the above DMAS genes is upregulated under Fe-deficient conditions in root tissue, and that of OsDMAS1 and TaDMAS1 are upregulated in shoot tissue. Western blot analysis confirmed that expression of DMAS is upregulated under Fe-deficiency and it seems that DMAS is not regulated posttranscriptionally. Moreover, it seems that low expression of DMAS is a rate limiting factor responsible for the low production of MAs in rice. OsDMAS1 promoter-GUS analysis in Fe-sufficient roots showed that its expression is restricted to cells participating in long-distance transport, and that it is highly upregulated in entire root under Fe-deficient conditions. In shoot tissue, OsDMAS1 promoter drove expression in vascular bundles specifically under Fe-deficient conditions. With the cloning of graminaceous DMAS, all the genes of MA biosynthetic pathway have been cloned form barley and rice. The cloning of DMAS is an important step in understanding the Fe acquisition and will help to develop transgenic rice highly resistant to Fe-deficiency in alkaline soils.

2). Cloning of glutathione reductase from barely

　Glutathione reductase (GR) plays an important role in the response to biotic and abiotic stresses in plants like salt stress, high temperature, low temperature and pathogen attack. Although GR is also involved in response to Fe-toxicity, little is know about expression patterns of GR under Fe-deficient conditions. The expression patterns and enzyme activities of GR in graminaceous plants under Fe-sufficient and Fe-deficient conditions were examined by isolating cDNA clones for chloroplastic GR (HvGR1) and cytosolic GR (HvGR2) from barley. It was found that the sequences of GR1 and GR2 were highly conserved in graminaceous plants. Based on their nucleotide sequences, HvGR1 and HvGR2 were predicted to encode polypeptides of 550 and 497 amino acids, respectively. Both proteins showed in vitro GR activity, and the specific activity for HvGR1 was threefold that of HvGR2. Northern blot analyses were performed to examine the expression patterns of GR1 and GR2 in rice (Oryza sativa), wheat (Triticum aestivum), barley (Hordeum vulgare), and maize (Zea mays). HvGR1, HvGR2, and TaGR2 were upregulated in response to Fe-deficiency. Moreover, HvGR1 and TaGR1 were mainly expressed in shoot tissues, whereas HvGR2 and TaGR2 were primarily observed in root tissues. It was observed that the expression of HvGR2 follows a diurnal rhythm in Fe-sufficient and Fe-deficient plants. The GR activity increased in roots of barley, wheat, and maize and shoot tissues of rice, barley, and maize in response to Fe-deficiency. Furthermore, it appeared that GR was not posttranscriptionally regulated, at least in rice, wheat, and barley. These results suggest that GR may play a role in the Fe-deficiency induced stress response in graminaceous plants.

3). Cloning and Characterization of OsGTL1

　Glutathione (GSH) is involved in many aspects of plant growth and development including redox control, storage and transport of reduced sulfur, and response to biotic and abiotic stresses. The transport and compartmentalization of GSH is essential to perform all these functions. A GSH transporter (GT) like genes was cloned from rice (OsGTL1). OsGTL1 is a putative member of oligopeptide transporters (OPT) family, and was identified through microarray analysis as its expression was highly upregulated in response to Fe-deficiency in root and shoot tissue. OsGTL1 was predicted to encode a polypeptide of 757 amino acids containing 12 putative transmembrane domains.　It contains the NPG domain (NPGPFxxKEH) and KP domain (KLGHYMKIPPR) earlier identified in AtOPTs. Seven homologs of OsGTL1 were identified in rice including previously characterized OsGT1. OsGTL1 showed high homology i.e. 82% homology to BjGT1 and 80% homology to AtOPT3. Northern blot analysis confirmed that the expression of OsGTL1 is induced in response to Fe deficiency. OsGTL1:green fluorescent protein (GFP) was localized to the plasma membrane of onion epidermal cell. Electrophysiological measurements using Xenopus leavis oocytes showed that OsGTL1 is a functional GSH transporter. GUS expression driven by OsGTL1 promoter was not observed in Fe-sufficient roots. In contrast, in Fe-deficient roots, high level of OsGTL1 promoter derived GUS expression was observed near root tips and the expression diluted as the distance from root tip increased. In shoot tissue, OsGTL1 promoter's expression was observed in whole leaf under Fe-deficient and specifically in vascular bundle under Fe-sufficient conditions. These results suggested that OsGTL1 is a novel glutathione transporter up-regulated under Fe-deficient conditions and may play a critical role in Fe-deficiency induced stress in rice.

Fig.1 Unrooted phylogenetic tres of the aldo-koto reductaso superfamily (AKR)

Fig.2 Effect of pH on enzyme activity of recombinant DMAS proteins

　全陸地の約25%を占める石灰質アルカリ土壌では、土壌中の鉄が水酸化第二鉄として沈殿し不溶態であるために、植物はこれを吸収できない。イネ科植物はムギネ酸類と総称されるキレーターを根から分泌して、三価の鉄を可溶化し、「鉄-ムギネ酸類」錯体として固有のトランスポーターにより吸収することによって必須元素である鉄を獲得する。鉄欠乏をシグナルとして、ムギネ酸の合成と分泌は飛躍的に上昇する。ムギネ酸類は、メチオニンを出発として、S-アデノシルメチオニン、ニコチアナミン、ケト体、デオキシムギネ酸、ムギネ酸、その他のムギネ酸類の順に生合成される。近年の研究により、ムギネ酸類生合成経路の酵素遺伝子はひとつの酵素を除いてすべて単離された。本論文は、唯一残されていた、ケト体からデオキシムギネ酸を生成する反応を触媒する酵素の遺伝子を単離することを目的とし、さらにイネ科植物の鉄-ホメオスタシスを分子レベルで解析するために、cDNAマイクロアレイ法を用いてイネの鉄欠乏誘導性遺伝子群を網羅的に解析し、鉄欠乏誘導性の新規グルタチオントランスポーター遺伝子を単離した。さらにオオムギから細胞質型と葉緑体型の2つのグルタチオン還元酵素遺伝子を単離した。全体は4章から構成されている。

　第1章では、序論として研究の背景、目的と意義について述べられている。

　第2章では、ムギネ酸類生合成経路上の酵素遺伝子のうち、唯一単離されていなかったデオキシムギネ酸合成酵素遺伝子のイネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシからの単離について述べられている。2つのアプローチにより単離を目指した。デオキシムギネ酸生合成の最終ステップは、ニコチアナミンの末端アミノ基がニコチアナミンアミノ基転移酵素により転移され、生成したケト体を、NADPHを電子供与体に用いて還元する反応である。この反応から、目的とする酵素はアルド・ケト還元酵素スーパーファミリーに属するものと仮定した。また、これまで単離した生合成経路の酵素遺伝子はすべて鉄欠乏によって強く発現が誘導されることから、この酵素遺伝子も鉄欠乏によって発現誘導されると推定した。まず、このファミリー内に存在するいくつかの保存されたアミノ酸配列のなかから2つの領域を選び、ディジェネレイトプライマーを設計してPCRを行った。得られたPCR断片のうち、鉄欠乏で誘導されるものをノーザン解析により選抜し、そのPCR断片を用いて鉄欠乏オオムギ根cDNAライブラリーから候補遺伝子のスクリーニングを行った。得られたcDNAクローンを酵母に導入して、そのタンパク質産物がデオキシムギネ酸合成酵素活性を持つかどうかを検定したところ、酵素活性は検出できなかった。その後の研究により、このタンパク質産物はグルタチオン還元酵素活性を持つことが明らかになり、オオムギのグルタチオン還元酵素遺伝子の単離となった(第3章に記述)。そこで次に、イネのマイクロアレイ解析により得られた鉄欠乏誘導性遺伝子群のなかから、アルド・ケト還元酵素スーパーファミリーに属すると推定される還元酵素遺伝子を選びだし、デオキシムギネ酸合成酵素活性を持つかどうかを調べた。その結果、イネのデオキシムギネ酸合成酵素遺伝子、DMAS1を同定することに成功した。イネの配列をもとに、オオムギ、コムギ、トウモロコシからもそれぞれデオキシムギネ酸合成酵素遺伝子を単離した。いずれの遺伝子も、そのコードするタンパク質が酵素活性を持つことをin vitroアッセイ系で確認した。いずれの遺伝子も鉄欠乏の根で発現が誘導された。本研究により、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシからデオキシムギネ酸合成酵素遺伝子が初めて単離され、ムギネ酸類合成経路上のすべての酵素の遺伝子が明らかになった。

　前述のように、第3章ではオオムギからグルタチオン還元酵素遺伝子を単離し、解析した結果について述べている。葉緑体型(HvGR1)と、細胞質型(HVGR2)との2種類の遺伝子を単離した。

　第4章では、鉄欠乏によって誘導されるグルタチオントランスポーター遺伝子のイネからの単離が述べられている。イネマイクロアレイ解析によって得られた鉄欠乏誘導性遺伝子群のなかに、オリゴペプチドトランスポーター遺伝子ファミリーに属する遺伝子が含まれていた。この遺伝子をイネから単離し、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた系により、そのタンパク質産物の基質輸送活性を電気生理学的に調べたところ、グルタチオンを輸送することが明らかになった。本研究により、鉄欠乏によって発現が誘導されるイネグルタチオントランスポーター遺伝子が始めて単離された。第3章の結果とあわせると、グルタチオン還元酵素遺伝子や、グルタチオントランスポーター遺伝子の発現が鉄欠乏によって上昇する事実は、鉄濃度を感知する鉄センサーから遺伝子発現制御までの鉄栄養シグナル伝達経路と、グルタチオンを介したレドックス制御機構の間にクロストークが存在する可能性を示唆している。本研究結果は、細胞内レドックス制御と細胞内鉄ホメオスタシスの維持との間の関係を示唆しており、細胞内の鉄の過不足を感知するセンサー、あるいはそのシグナルを伝達して遺伝子発現を制御する情報伝達のメカニズムの解明に迫ることを可能とするものであると考えられる。

　以上のように、本論文は、これまでムギネ酸合成経路上で唯一未同定だったデオキシムギネ酸合成酵素の遺伝子の単離に成功し、また鉄欠乏によって誘導されるグルタチオン還元酵素遺伝子や、グルタチオントランスポーター遺伝子を単離することによって、イネ科植物の鉄ホメオスタシスの維持に関する新たな知見を提供し、新規性と独創性に富む内容であり、今後の研究の発展に大いに貢献することが期待される。よって、審査委員一同は、本論文を博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。