Neurotransmitter, such as the major excitatory neurotransmitter L-glutamate, in the developing mammalian central nervous system (CNS), is a double-edged sword: which is indispensable to mediate signal transmission and leads normal neuronal development, in contrast, excessive synaptic glutamate interferes terminating signal transmission and leads neuronal degeneration. Thus, neuronal networks should keep glutamate concentration within a relatively narrow range to hold a balance of these good or evil effects to maintain normal development. However, it can be furthermore hypothesized that glutamate itself might have multiple functions as 1) feedback its own effect, or 2) modulated by other neurotransmitters, or 3) change its own function according to the neuronal network maturation, to minimize glutamate consumption and obtain maximal information effectively.

　In this thesis, I performed three experiments, using synchronized and periodical calcium (Ca(2+)) spikes, which occur without external stimuli in primary cultured CNS cells. First, I consider each Ca(2+) spike represents the index of neuronal activity, as Ca(2+) spikes were resulted from periodic burst firing of action potentials (see chapter 1). I also confirmed that ionotropic glutamate receptors (iGluRs) were involved in this spontaneous Ca(2+) spikes, thus I deeply pay attention to glutamatergic transmission as essence to maintain Ca(2+) spikes. Secondly, I consider Ca(2+) spikes as in vitro model of neuronal development, because the frequency of Ca(2+) spikes changes concomitant with synapses increasing (see chapter 3).

　Recently it was revealed that glutamate, without external stimuli, induce the large spatial synchronized and periodical Ca(2+) spikes in neuronal network in slices of newborn rats, and this activity is maintained until the developmental transition of the GABAergic transmission from depolarization to hyperpolarization(Garaschuk et al. 2000). Additionally, it is known that endogenous glutamate induce synchronized and periodical Ca(2+) spikes in primary cultured neurons obtained from embryonic or neonatal rat cerebral cortex. The phenomenon are occurred also without external stimuli, during the period of in vitro neuronal network maturation, resulting from periodic burst firing of action potentials(Leinekugel et al. 1997; Wang and Gruenstein 1997; Bacci et al. 1999). These Ca(2+) activities induced by glutamate in developing CNS or neuronal network, can be hypothesized encoding information and playing an important role in neuronal development, such as neuronal differentiation, motility of axonal and dendritic growth cones, and connection patterning(Shatz 1990; Spitzer 1994; Gu and Spitzer 1995; Katz and Shatz 1996; Komuro and Rakic 1996; Feller 1999; Zhang and Poo 2001). For example, the speed of growth cone migration in the developing spinal cord is reported to be controlled by the frequency of spontaneously Ca(2+) transients: growth cones experiencing a high frequency of Ca(2+) transients (10-12 times per h) migrate slowly or retract, whereas growth cones experiencing a low frequency of Ca(2+) transients (0-0.4 times per h) migrate rapidly(Gomez and Spitzer 1999).

　I therefore used periodical Ca(2+) spikes in primary cultured neurons as in vitro model of neuronal development, which manage to control glutamate, the dangerous element, and then performed following three experiments focusing on its frequency or the pattern of abolishment.

Chapter 1: The regulation of the frequency of Ca(2+) spikes in relatively homogeneous cerebral cortical neurons

Chapter 2: The regulation of Ca(2+) spikes between heterogenous midbrain neurons: glutamatergic and dopaminergic neurons

Chapter 3: The regulation of Ca(2+) spikes between heterogenous cells: neurons and astrocytes

　In chapter 1, I demonstrate that metabotropic glutamate receptors (mGluRs) were involved in the synchronized Ca(2+) spikes, in addition to the involvement of iGluRs. I revealed that glutamate-induced signals through mGluRs decreased the frequency of Ca(2+) spikes, mainly due to the signal through group II mGluR, inactivation of adenylate cyclase-cAMP-PKA signaling pathway. That is, glutamate generates the synchronized Ca(2+) spikes through iGluRs and modulates simultaneously their frequency through group II mGluR-adenylate cyclase-cAMP-PKA signaling pathway in the present cerebral cortical neuronal network.

　In chapter 2, I demonstrate that, in addition to glutamate, endogenous dopamine were involved in synchronized Ca(2+) spikes in midbrain neuronal network. The regulation of dopamine was distinctly different through two dopamine receptor families, dopamine receptor 1 (D1R) and 2 (D2R): the action of dopamine through D1R or D2R was facilitative or suppressive, respectively, to the Ca(2+) influx of synchronized Ca(2+) spikes. I further confirmed that the suppressive effects of D2R were mediated by the regulation of Ca(2+) influx through L-type voltage-gated Ca(2+) channel, not through NMDA receptor.

　In chapter 3, I demonstrate the importance of astrocytes, predominant glial cell in the CNS, to maintain normal spontaneous Ca(2+) spikes in primary cultured cortical cells. I present that astrocytes suppressively regulate neuronal Ca(2+) spikes via glutamate transporter 1 (GLT-1) throughout the neuronal development. However, this regulation of GLT-1 may switch from suppression on Ca(2+) spike occurrence to suppression on frequency of Ca(2+) spikes during the formation of neuronal network.

　Neurons in during the formation of network appear to add several functions to one neurotransmitter, for strict regulation of normal neuronal development. Thus glutamate indeed had multiple functions as 1) feedback its own effect, or 2) modulated by other neurotransmitters, or 3) change its own function according to the neuronal network maturation, to minimize glutamate consumption and obtain maximal information effectively. The concept that one neurotransmitter is actually multiple players might further apply to other non-neuronal cell communications especially in the period of development.

　胎生期に、脳はその機能・形態をダイナミックに発達させる臓器であるが、脳の発達を推し進める現象として、細胞内カルシウム濃度の波状変化、カルシウムオシレーションが知られている。一方、生体から取り出した神経細胞をシャーレの中で高密度培養すると、in vitroであるにも関わらず、生体において生じるカルシウムオシレーションと頻度・波形とも非常に類似したオシレーション(カルシウムスパイク)が自発的に生じることが知られている。つまり、生体の脳発達に不可欠な現象、オシレーションを、培養した細胞においても生じさせることができるわけであり、培養細胞のカルシウムスパイクは生体のオシレーションを反映するとされている。この発達期に特徴的に出現するカルシウムオシレーションについて申請者は、グルタミン酸を主軸として限られた濃度の範囲(カルシウム・グルタミン酸両者共)で効果的に利用するために発生すると考えており、その仮説の証明に迫るために以下の実験を行った。

【カルシウムスパイクにおけるグルタミン酸の役割】

　神経細胞の自発的カルシウムスパイクの発生には、イオンチャネル型グルタミン酸受容体(iGluR:AMPA受容体、NMDA受容体等の神経細胞の活動電位発生に直接的役割を果たす受容体)を介したグルタミン酸による情報伝達が必須であることを明らかにし、そこから展開し以下の結論を新たに得た。

　初代培養大脳皮質神経細胞においては、グルタミン酸という一つの物質がiGluRとmGluR(代謝型グルタミン酸受容体(GPCR))という二種類の受容体を使い分けることにより、

I)iGluRへの結合によって神経細胞カルシウムスパイクの「発生」を、II)mGluRへの結合によって神経細胞カルシウムスパイクの「頻度抑制」を行っていることを明らかにした。

【カルシウムスパイクにおけるドーパミンの役割】

　申請者は、ドーパミン系の起始核(ドーパミン作動性神経細胞が豊富に存在する)である中脳の初代培養細胞カルシウムスパイクにおいて、グルタミン酸以外の伝達物質であるドーパミンの役割を調べ、以下の知見を得た。

I)ドーパミンはドーパミン受容体1に作用して、グルタミン酸の神経伝達をさせやすくすることによりカルシウム流入を促進する。

II)ドーパミンはドーパミン受容体2に作用して、グルタミン酸伝達をさせにくくし、L型カルシウムチャネルを通るカルシウム流入を抑制する。

【神経細胞カルシウムスパイクに対するアストロサイトの役割】

　従来、神経細胞を支持する細胞とされてきたアストロサイトが、近年はより主体的な活動を担う存在として注目されてきている。そこで、神経細胞カルシウムオシレーションに対するアストロサイトの役割を検索した。

　アストロサイトは神経細胞によりシナプスに放出されたグルタミン酸を回収することによって、

I)回路網形成が未熟な神経アストロサイト共培養系では、神経細胞カルシウムスパイクの「発生の抑制」を、

II)成熟回路網を形成した共培養系では、神経細胞カルシウムスパイクの「頻度抑制」を

行っていることを明らかにした。

まとめると、これらの現象の意義は以下のように解釈された。

(1)グルタミン酸には、神経伝達物質として回路網の主軸をなすという働きの他、修飾物質として、スパイク頻度の調節を行う働きも有する。

(2)修飾物質であるドーパミンは、グルタミン酸の伝達のしやすさを修飾している。

(3)神経細胞以外の細胞であるアストロサイトのグルタミン酸回収作用が、神経細胞-神経細胞間のグルタミン酸の作用を修飾している。

　申請者のこの博士論文は、発達期の脳の厳密な調節のために、「伝達物質としてだけではなく修飾物質としてもグルタミン酸を用いていること」「中脳ではグルタミン酸の他にドーパミンを修飾物質として用いること」「神経細胞以外の細胞であるアストロサイトの作用が関与していること」によって神経伝達の主軸を担うグルタミン酸を限られた範囲の濃度で効率よく活用する、という新しい概念を提起するものであり、博士号を与えるにふさわしいものとして、審査委員一同の合意を得た。