第1編　広い濃度領域で測定可能な亜鉛蛍光プローブの開発

第1章　序論

　亜鉛イオン(Zn(2+))は生体内において鉄に次いで多く存在する必須微量金属元素であり、大部分はタンパク質と強固な結合を形成し、構造保持や酵素の活性中心として働いている。その一方でタンパク質に結合しない、または弱く結合しているZn(2+)も多く存在する。特に脳内のZn(2+)の約10%は遊離した状態であり、神経細胞のシナプス小胞内に局在している。しかし遊離したZn(2+)の生理的な役割に関してはほとんど解明されていない。小胞内のZn(2+)は脱分極刺激によってシナプス間隙に放出されるため、神経伝達に関与している可能性がある。また神経系疾患への関与も示唆されており、現在注目を集めているイオンである。ところがZn(2+)の動態を調べる手段は非常に限られているのが現状である。

　この状況下、細胞内の生理活性物質を生きた状態のままで可視化できる蛍光イメージングが近年注目されており、多くのZn(2+)蛍光プローブが開発されている。当教室ではZn(2+)選択的蛍光プローブZnAF-2の開発に成功し、生体内のZn(2+)の動態解明に寄与している。ZnAF-2はCa(2+)やMg(2+)など他の生理的に重要なイオンには全く影響を受けない。また、Zn(2+)に対するみかけの解離定数(Kd)はnMオーダーであり、低濃度(0.1 nM〜10 nM)のZn(2+)を検出することができる。しかし私は中枢神経系において高濃度(>μM)のZn(2+)が放出される点に着目した。ZnAF-2を用いた場合、高濃度では蛍光強度が飽和するため、Zn(2+)の存在の有無に関する定性的な評価はできても、詳細な濃度変化を追うことができない。nM程度の低濃度からmM程度の高濃度までの広い濃度範囲でZn(2+)濃度変化を測定するためにはプローブを低親和性にする、つまり大きなKd値を有するプローブも必要である。そこでZn(2+)に対する選択性を維持したまま親和性を変化させた蛍光プローブの開発を行った。

第2章　広い濃度領域で測定可能な亜鉛蛍光プローブZnAF類の開発

　Zn(2+)に対する選択性を維持したまま親和性を変化させるために、Fig. 1に示すZnAF類を新たにデザインし、合成した。ZnAF類のZn(2+)濃度に対する蛍光強度変化を調べたところ、いずれもZnAF-2よりも高濃度の領域で蛍光強度が変化することがわかった(Fig. 2)。これら6種類のプローブを組み合わせて用いれば、10(-10)〜10(-3) Mと広い範囲にわたるZn(2+)の濃度変化を捉えられる。またZnAF類はZn(2+)に対する選択性が非常に高いことも確認され、高濃度のCa(2+)やMg(2+)に全く影響を受けなかった。

第3章　ZnAF類の生細胞系への応用

　続いてZnAF類を用いて、神経細胞から放出されるZn(2+)の蛍光イメージングを行った。海馬スライスにKClを加えて脱分極刺激したところ、海馬の各領域で蛍光強度が増大した(Fig. 3)。ZnAF-2 (a, Kd=2.7 nM)では歯状回(DG)、CA3、CA1の各領域で蛍光強度が増大したのに対し、ZnAF-4(c, Kd=0.79 μM)ではDGのみ蛍光強度が増大した。つまりDGではより高濃度のZn(2+)が放出されていることが示された。細胞外Zn(2+)選択的キレーターであるCaEDTAを加えたところ、この蛍光上昇は抑えられたので、細胞外のZn(2+)に由来していることが確認された。

第4章　総括

　ZnAF-2の蛍光強度は海馬の各領域で飽和するため、Zn(2+)を検出できても詳細な濃度分布は調べられない。ZnAF類を組み合わせて用いることで、領域間のZn(2+)放出濃度の違いが初めて示された。複数のプローブによるZn(2+)の濃度評価は今回が初めてであり、ZnAF類の蛍光強度変化の有無のみで検討できる点で、信頼性が高いといえる。現在までにkd値のコントロールを目的としたプローブの開発は全くなされていなかった。本研究では生体内Zn(2+)が幅広い濃度変化をすることに着目し、様々なKd値を持つ蛍光プローブ、ZnAF類を開発することで、神経細胞より放出されるZn(2+)の詳細な解析に初めて成功した。

第2編　イミノクマリンを母核に用いた新規波長変化型蛍光プローブの開発

第1章　序論

　生体内に存在する金属イオン、酵素等の作用機序を明らかにするための手段として蛍光プローブを用いたイメージング法が汎用されている。蛍光プローブとは、標的分子と反応もしくは結合することにより、励起波長、蛍光波長、蛍光強度等の蛍光特性が変化する機能性分子である。蛍光プローブを用いて細胞または組織中の生理活性物質を可視化する場合、目的とする応答以外にも蛍光団の周りの環境(pH、溶媒の極性、温度など)や蛍光プローブ自身の局在、濃度変化、退色などの要因による蛍光強度の変化が頻繁に観測される。これらの要因の影響を受けにくくする方法として波長変化型プローブを用いたレシオ測定が一般的に用いられる。レシオ測定とは、励起波長あるいは蛍光波長を変えて同じ試料の測定を行い、その蛍光強度比を検出する測定法である。しかしレシオ測定を可能とする波長変化型プローブの多くは紫外光励起であり、また水中での蛍光量子収率も充分でないなどプローブの骨格として満足のいくものではなかった。例えば可視光励起が可能な波長変化型Ca(2+)プローブとしてクマリンを母核に用いたBTCが市販されているが、量子収率が0.1よりも小さく汎用されるにはいたっていない。このような状況下、本研究では新たな蛍光団としてイミノクマリンに着目した。イミノクマリンの優れた蛍光特性を活かすことで、新規波長変化型蛍光プローブを開発することを目標とした。

第2章　母核となる蛍光団　-イミノクマリン-

　クマリンは蛍光色素として数多くの研究がなされ、様々な分野に応用されているのに対し、イミノクマリンに関する研究はほとんどない。しかしイミノクマリンは蛍光プローブの母核として優れた蛍光特性を持っていることが判明した。具体的には、Fig. 4に示すクマリン(1、2)とイミノクマリン(3、4)を合成し、水中pH 7.4での蛍光スペクトルを比較した。その結果、イミノクマリン4のみが強い蛍光を有していた。蛍光量子収率は0.63と算出され、さらに吸収、及び蛍光極大波長は500 nmを超えていた(Table 1)。クマリン系統の化合物では、4の様に水中で長波長領域に強い蛍光を持つものは知られていない。またイミノクマリンはイミノ基を介して様々な誘導体を合成することも可能である。そこでイミノクマリン4を母核に用いることで、さらに優れた波長変化型蛍光プローブの開発を目指した。

第3章　波長変化型亜鉛蛍光プローブの開発

　波長変化型蛍光プローブの開発を目指し、イミノ基を修飾した化合物5を新たに合成した(Fig. 5a)。プローブのターゲットは生体内での役割が注目されているZn(2+)を選び、キレーターとの配位によって波長が変化することを期待した。5にZn(2+)を添加したところ、蛍光波長が長波長側にシフトすることがわかった(Fig. 5b)。励起波長は500 nmを超えており、水中での量子収率はZn(2+)配位前後で、0.80、0.76と非常に高い値を示した(Table 2)。この結果より、5は水中で強い蛍光を持ち、かつ長波長励起が可能な波長変化型Zn(2+)蛍光プローブとして機能することが明らかとなった。

　5の他の金属イオンに対する選択性は非常に高く、生体内で遊離の状態で大量に存在するNa+、K+、Ca(2+)、Mg(2+)に対して全く影響を受けなかった(Fig. 6a)。そしてpH変化の影響を受けずにZn(2+)を検出できることも示された(Fig. 6b)。またZn(2+)との解離定数は1.3 pMと算出され、これまで報告されたどのZn(2+)プローブと比べても極めて強い親和性を持っていた。

　Zn(2+)プローブ5を生細胞内Zn(2+)のレシオイメージングに応用した。5は細胞膜透過性があり、5を含む溶液中で細胞(HEK293)をインキュベーションした結果、細胞内に5が局在した。その後、2種類の蛍光画像(565-605 nm、510-550 nm)を取得し、それをもとにしたレシオイメージングを行った(Fig. 7)。細胞外液にZn(2+)のイオノフォアであるPyrithioneとZn(2+)を加え、細胞内のZn(2+)濃度を上昇させると細胞内領域でのレシオの増大が観察された。また、膜透過性のZn(2+)キレーターであるTPENを加えて、細胞内のZn(2+)の濃度を減少させるとレシオも減少した。以上の結果から、5は細胞内Zn(2+)の濃度変化をレシオイメージングによって検出可能であることが示された。

　続いて5を用いたレシオイメージングによって、脳内のZn(2+)を検出できるかを検討した。ラット海馬スライスの5による染色画像をFig. 8に示す。蛍光像では図左下に強い蛍光がみられたが、レシオをとることで、そうした色素の局在の影響を受けずに脳内のZn(2+)を検出できた。イメージングの結果、Zn(2+)は歯状回(DG)とCA3の他に、CA1でも検出されていることがわかった。確認のためにTPENを外液に加えて細胞内のZn(2+)濃度を減少させるとレシオ値が減少したので、5は脳内のZn(2+)を検出しているといえる。

　海馬に存在するZn(2+)のレシオイメージングに成功したのは今回が初めてである。そして蛍光イメージングよってCA1領域のZn(2+)を検出することに成功したのも今回が初めてである。5はZn(2+)の動態を解明する非常に有力な手段になると考えられる。

第4章　イミノクマリンの蛍光特性解明と蛍光プローブへの応用

　7位に水酸基を持つイミノクマリン6も優れた蛍光特性を持っていた(Fig. 9a)。6はそのクマリン類縁体と比べて約7倍の蛍光強度を有しており、量子収率は0.74、モル吸光係数は53000(M(-1)4cm(-1))と算出された。蛍光プローブの母核として優れているといえる。

　その上6の励起スペクトルは酸性側で大きく変化し、波長変化型pHプローブとして機能することが明らかとなった(Fig. 9b)。今後波長変化型pHプローブとして6の生体応用が期待できる。

　また6はZn(2+)プローブ5と同様に、細胞内に局在する性質を持っていた。6を母核に用いたβ-ガラクトシダーゼ蛍光プローブ7を新たに開発したところ(Fig. 10)、酵素反応によって蛍光強度が約500倍に増加した。そしてプローブ7を細胞に応用した結果、lac Zを発現した細胞のみ選択的に染色することに成功した。染色された細胞では色素が細胞外に漏れ出ることはほとんどなく、長時間強い蛍光を保っていた。このように細胞内に集積する点もイミノクマリンを蛍光プローブの母核として用いるメリットの一つと考えられる。

第5章　総括

　本研究ではイミノクマリンが蛍光プローブの母核として優れた性質を持っていることを新たに見出した。そしてイミノクマリンを用いることで、蛍光特性に優れた波長変化型Zn(2+)蛍光プローブ5を開発することに成功した。5は生細胞系への応用が可能であり、海馬に存在するZn(2+)をレシオイメージングによって検出することに成功したのは世界で初めてである。本研究はZn(2+)だけでなく、様々な分子を標的とする波長変化型蛍光プローブ開発の端緒になると考えている。

Fig. 1　ZnAF類の構造

Fig. 2　ZnAF類のZn(2+)濃度に対する蛍光強度変化

Fig. 3　ZnAF類によるZn(2+)イメージング　ラット海馬スライスを調整し1 μM ZnAF存在下イメージングを開始した。1分後に50 mM KCl加え、10分後に50 mM EDTAを加えた。(左より)透過像、蛍光像(0、3、15分後)

Fig. 4　クマリンとイミノクマリンの水中pH 7.4での蛍光スペクトル

Table 1　各化合物の水中pH 7.4での蛍光特性

Fig. 5　(a)Zn(2+)プローブの構造　(b)Zn(2+)による波長変化

Table 2　Zn(2+)プローブ5の水中pH 7.4での蛍光特性

Fig. 6　(a)Zn(2+)プローブ5の金属イオン選択性　(b)Zn(2+)プローブ5のpH依存性

Fig. 7　培養細胞を用いたZn(2+)のレシオイメージング

Fig. 8　ラット海馬スライスを用いたZn(2+)のレシオイメージング

Fig. 9　(a)7位に水酸基を持つイミノクマリンの構造　(b)イミノクマリン6の励起スペクトル

Fig. 10　β-ガラクトシダーゼ蛍光プローブ

小松兼介の研究成果は以下の2つの内容から構成されている。

1.　広い濃度領域で測定可能な亜鉛蛍光プローブの開発に関する研究

　亜鉛イオン(Zn(2+))は生体内において鉄に次いで多く存在する必須微量金属元素であり、大部分はタンパク質と強固な結合を形成し、構造保持や酵素の活性中心として働いている。その一方でタンパク質に結合しない、または弱く結合しているZn(2+)も多く存在する。特に脳内のZn(2+)の約10%は遊離した状態であり、神経細胞のシナプス小胞内に局在している。しかし遊離したZn(2+)の生理的な役割に関しては不明な点が多い。小胞内のZn(2+)は脱分極刺激によってシナプス間隙に放出されるため、神経伝達に関与している可能性がある。また神経系疾患への関与も示唆されている。

　この状況下、細胞内の生理活性物質を生きた状態のままで可視化できる蛍光イメージングが機能解析の観点から注目されており、数種のZn(2+)蛍光プローブが開発されている。当教室ではZn(2+)選択的蛍光プローブZnAF-2の開発に成功し、生体内のZn(2+)の動態解明に寄与している。ZnAF-2はCa(2+)やMg(2+)など他の生理的に重要なイオンには全く影響を受けない。また、Zn(2+)に対するみかけの解離定数(Kd)はnMオーダーであり、低濃度(0.1 nM〜10 nM)のZn(2+)を検出することができる。しかしながら、中枢神経系において高濃度(>μM)のZn(2+)の放出が示唆されており、ZnAF-2だけではZn(2+)の存在の有無に関する定性的な評価はできても、詳細な濃度変化を追うことができない。nM程度の低濃度からmM程度の高濃度までの広い濃度範囲でZn(2+)濃度変化を測定するためにはプローブを低親和性にする、つまり大きなKd値を有するプローブが必要である。小松君はZn(2+)に対する選択性を維持したまま親和性を変化させた蛍光プローブの開発を行った。

　種々検討した結果、ZnAF-2に加えて、Zn(2+)に対する親和性が異なるZnAF-2M、ZnAF-2MM、ZnAF-3、ZnAF-4、ZnAF-5の6種類のプローブの開発に成功した。これらのプローブを組み合わせて用いることで、10(-10)~10(-3) Mと広い範囲にわたるZn(2+)の濃度変化を捉えることができるようになった。

　これらのプローブZnAF類を神経細胞へ応用し、その有用性も実証した。すなわち、生体内Zn(2+)が幅広い濃度変化をすることに着目し、様々なKd値を持つ蛍光プローブであるZnAF類を用いることで、神経細胞より放出されるZn(2+)の詳細な解析に初めて成功した。

2.　イミノクマリンを母核に用いた新規波長変化型蛍光プローブの開発に関する研究

　生体内に存在する金属イオン、酵素等の作用機序を明らかにするための手段として蛍光プローブを用いたイメージング法が汎用されている。蛍光プローブを用いて細胞または組織中の生理活性物質を可視化する場合、目的とする応答以外にも蛍光団の周りの環境(pH、溶媒の極性、温度など)や蛍光プローブ自身の局在、濃度変化、退色などの要因による蛍光強度の変化が頻繁に観測される。これらの要因の影響を受けにくくする方法として波長変化型プローブを用いたレシオ測定が有用である。レシオ測定とは、励起波長あるいは蛍光波長を変えて同じ試料の測定を行い、その蛍光強度比を検出する測定法である。しかしレシオ測定を可能とする波長変化型プローブの多くは紫外光励起であり、また水中での蛍光量子収率も充分でないなどプローブとして満足のいくものではなかった。例えば可視光励起が可能な波長変化型Ca(2+)プローブとしてクマリンを母核に用いたBTCが市販されているが、量子収率が0.1よりも小さく汎用されるにはいたっていない。このような状況下、小松君は新たな蛍光団としてイミノクマリンに着目し、イミノクマリンの優れた蛍光特性を活かすことで、多種類の新規波長変化型蛍光プローブを開発することに成功した。

　現在までにクマリンは蛍光色素として数多くの研究がなされ、様々な分野に応用されているのに対し、イミノクマリンに関する研究はほとんどない。小松君は、イミノクマリンが蛍光プローブの母核として優れた蛍光特性、すなわち水中で長波長領域(蛍光極大波長500nm超)に強い蛍光(蛍光量子収率:0.63)を有することを明らかにした。クマリン系統の化合物では、水中で長波長領域に強い蛍光を持つものは知られていない。またイミノクマリンはイミノ基を介して様々な誘導体を容易に合成できる。これらはイミノクマリンを母核として多種類の優れた波長変化型蛍光プローブを開発することが可能であることを示している。この考えに基づいて、小松君は水中で強い蛍光を持ち、かつ長波長励起が可能な波長変化型Zn(2+)蛍光プローブの開発を行った。その結果、他の金属イオンに対する選択性が高く、pH変化の影響を受けず、特異的にZn(2+)に高い親和性を有するプローブの開発に成功した。このプローブは細胞内あるいは脳内のZn(2+)の濃度変化をレシオイメージングにより検出できることも明らかにした。海馬、CA1領域に存在するZn(2+)のレシオイメージングに成功したのはこれが初めてである。このプローブがZn(2+)の動態を解明する非常に有力な手段であることを明らかにした。

　さらに、他のイミノクマリン誘導体として波長変化型pHプローブおよび波長変化型β-ガラクトシダーゼ蛍光プローブの開発にも成功した。これらのプローブを細胞外に漏出しないように化学修飾することも可能で、細胞内に集積させやすい点もイミノクマリンを蛍光プローブの母核としての長所である。

　上記の蛍光イメージングプローブ開発に関する研究は、薬学研究において特筆すべき内容であり、博士(薬学)に値するものと判断した。