真核細胞生物の遺伝子発現は主に3つの段階で制御されていると考えられる。

i)染色体機能領域および境界領域の形成　(サイレンシング・抗サイレンシング反応)

ii)染色体構造変換　(ヌクレオソーム・クロマチン構造変換反応)

iii)裸のDNAからの転写活性化・不活性化　(プロモーター特異的転写反応)

　真核細胞生物の遺伝子発現制御の理解には、上記のiii)のレベルの制御に加え、更に高次の構造体であるi)，ii)の染色体の領域レベルの制御の解明が不可欠であるが、この高次の制御の解明に関してはiii)の研究に比べてそれほどあるいはほとんど進んでいないのが現状である(1)。

　i)の染色体からの遺伝子発現制御に関わる研究は、上述したように染色体の活性化・不活性化領域およびそれら機能領域間の境界領域の形成がどのようになされるのかという問題に置き換えることができる。染色体の主要構成要素であるヒストンは、ヒストン修飾酵素と脱修飾酵素両者による可逆的な反応を受け、その働きが正負に制御されている。本研究室ではこれまでに、この課題を解明するために出芽酵母のテロメア領域をモデル系として取り組み、テロメア領域での染色体不活性化状態とその隣接領域での染色体活性化状態が、進化上保存されたヒストンH4のN末端から16番目のリジン残基(H4-K16)に対して相対する酵素活性を持つ、ヒストン脱アセチル化酵素Sir2pとヒストンアセチル化酵素Sas2p(2,3,4)によって、規定されることを明らかにした(5)。この結果から、染色体上の機能領域を区別する境界が2種類の相異なる修飾酵素の同一基質部位に対するせめぎあいを介して生まれるといった新しい分子機構(negotiable border model)を提唱するに至った(5,6)。

　発表者はこのNegotiable border modelを染色体機能領域及び境界領域形成の普遍的なモデルとして、反応系や生物種を越えた染色体からの遺伝子発現制御の基盤として成立しうるか否かを検討することにした。そこで、サイレンシング制御を受け、性決定の制御を司る接合型遺伝子座領域(HM loci)での解析を進めた。染色体末端領域であったテロメア領域は活性化・不活性化領域間の境界領域を1箇所想定すればよいだけであった。それに対し、HM lociは染色体内部に存在するため最低3箇所の機能領域および2箇所の境界領域を想定する必要がある。このHM lociでの解析を進めることで、より複雑な機能領域及び境界領域を想定する必要のある染色体領域においてのNegotiable border modelの普遍性や多様性を検証できると考えた。

　HM lociの一つであるHMR locusはそれぞれEサイレンサー、Iサイレンサーと呼ばれる2種類のDNAエレメントに挟まれた領域である。両サイレンサーの内側の領域はサイレンシング制御を受けており遺伝子は不活性化状態にあり、外側の領域は逆に抗サイレンシング制御を受けており遺伝子は活性化状態にある。Sas2，Sir2活性のせめぎ合いによってヒストンはHMR locus内側で低アセチル化状態に、HMR locus外側で高アセチル化状態に調節されていると想定し、H4-K16Acに対する抗体を使用したクロマチン免疫沈降法(ChIP)を行うことで、HMR locusにおけるH4-K16Acの分布状況を測定した。WT(野生株)とsas2，sir2欠損株との結果の比較により、Eサイレンサー側で見出した境界に関しては、Sas2p，Sir2p活性のせめぎ合いによってH4-K16Acの局在が規定されていることが明らかになった。一方、サイレンシング因子Sir3pの局在に関しては、WT及びsir2欠損株では、H4-K16が低アセチル化状態となっている領域にSir3pが高局在するといった相関性が見られ、H4-K16Acの局在に対応してSir3pの局在が規定される結果となった。一方、sas2欠損株では、HMR locus全領域にてH4-K16が低アセチル化状態となるにもかかわらずSir3pの局在が全体的に低下するという結果となった。このsas2欠損時のサイレンシング領域におけるSir3p局在の低下はテロメア最末端においても見られる現象であるが、この現象が引き起こされているのは、ゲノムの全領域が低アセチル化状態となったためSir3pの絶対量が不足して起こっていることが理由なのではないかと考えられる。

　Iサイレンサー側の境界に関しては、tRNA遺伝子付近に存在することが示されたが、tRNA遺伝子領域における低アセチル化及びSir3pの高局在がsir2pに依存せず維持されることより、Sas2，Sir2の組み合わせでは説明できない未知の領域制御が存在することが明らかになった。

　次に、H4-K16Acの局在がHMR locusにおいて、遺伝子発現レベルと関連しているかを検討した。HMR locusにおける個々の遺伝子からのmRNA発現量を、野生株と各種変異株間で定量RT-PCRで測定した。HMR locusではテロメア領域同様、Sas2p，Sir2pによって形成されるH4-K16Acの局在に対応して遺伝子発現が規定されていることが明らかになった。

　以上より、Eサイレンサー側の境界に関して、染色体機能領域を形成する各要素がSas2p，Sir2pの活性のバランスによって制御されていることを示す結果を得られたことから、HMR locusにおいてもNegotiable border modelが適用可能であることが示された(Fig.1)。

　HMR locusでの解析から、tRNA遺伝子領域では、Sas2p，Sir2pの組み合わせでは説明できない未知の領域が存在することが明らかとなった。この染色体領域形成における意義を考察するため、tRNA遺伝子の欠損株でのH4-K16Ac及びSir3pの局在性を解析した。HMR locus Iサイレンサーの隣に存在するGIT1遺伝子領域では、H4-K16Ac局在の低下とSir3pの局在増加が見られ、tRNA遺伝子領域がHMR locusにおけるサイレンシング活性のIサイレンサー側への移動を防いでいることが明らかになった(Fig.2)。

　HMR locusのtRNA遺伝子領域で検出されたH4-K16低アセチル化の要因は、ヒストンの量が不足することではなく未知の制御によってこの領域でのヒストンのアセチル化が阻害されていることが考えられた(Fig.3)。この結果に基づき、H4-K16部位以外でのヒストン化学修飾による制御の可能性を検討した。tRNA遺伝子領域で見られたSir3pの高局在を、ヒストンの様々な化学修飾部位に対する点変異株で解析したところ、Sir3pの局在に影響を与えるヒストン化学修飾部位を複数検出した。H4-K16以外の化学修飾によってtRNA遺伝子領域の機能領域形成が制御されていることが示唆された(Fig.4)。

　HM lociでの検証によって、テロメア領域以外の染色体領域で見られた、染色体機能領域および境界領域形成のNegotiable border modelが大筋で適用可能であることを明らかにした。

　その一方、新たな課題として、tRNA遺伝子領域にはテロメア領域で明らかにした染色体機能領域形成機構では説明されない点がみられた。ヒストン化学修飾部位点変異株を用いた解析により、H4-K16以外の部位の化学修飾によって制御されている可能性が示唆され、この制御を担う化学修飾酵素の同定を行い制御機構の解明を進める必要がある。tRNA遺伝子はRNAポリメラーゼIII系の遺伝子であり、HMR locusの解析結果によって、染色体領域制御機構がRNAポリメラーゼII，IIIの種類ごとに異なっているらしいことが明らかになったので、各々の関係を明らかにすることが今後の課題である。例えば、機能不明とされている高等生物のゲノムの大半を占めるAlu配列に代表される繰り返し配列の多くがRNAポリメラーゼIIIによって転写されるものであることから、これらの染色体機能領域形成の意義を解明しうる鍵になると考えられる。更にはRNAポリメラーゼI系の遺伝子領域であるrRNA遺伝子座におけるサイレンシング機構の解明を進めることで、真核細胞生物で起こったRNAポリメラーゼ分子の分化に関して、単に転写されるRNAの種類による多様性といった従来の考え方だけでなく、染色体機能領域及び境界領域の形成機構の分化といった染色体レベルでの多様性といった新しい考えを導入することが可能になると考えられる。

Fig.1　HMR locusにおける染色体領域形成モデル

Fig.2　tRNA遺伝子の欠損による染色体領域形成への影響の検証(a)H4-K16Ac局在(b)Sir3p局在

Fig.3　tRNA遺伝子領域におけるヒストンの局在

Fig.4　HMR locus tRNA遺伝子近傍領域におけるSir3p局在に対するヒストン化学修飾部位点変異体の彰響

(a)ヒストンH3(b)ヒストンH4

　1961年にオペロン説が提唱されて以降、転写制御研究の分野では、構造遺伝子と個々の遺伝子の発現特異性を担うDNAエレメント、DNAエレメントに結合するDNA結合性因子を基本的なセットとしてDNA蛋白質相互作用を中心に研究が進められ、その後さらに蛋白質・蛋白質相互作用による説明も加えられ、現在に至るまで各々の遺伝子、各々の転写因子を用いて、広く研究がなされている。しかしながら、DNAが塩基性蛋白質ヒストンに巻きつくことでヌクレオソーム構造をとり、さらに高次の構造であるクロマチン構造をとる真核細胞生物においては、従来の裸のDNAを対象としたモデルでは説明しきれない複雑な転写制御機構が働いていることが明らかになっている。近年になって、ヒストンシャペロン、ATPase，ヒストン化学修飾酵素に代表されるクロマチン関連因子によってヌクレオソームの構造変換が行われ、それによってDNAがヌクレオソーム状態から解かれ、転写活性化状態となることが明らかにされてきている。このような反応が、エピジェネティックに制御されているという概念形成がなされ、現在でも最先端研究分野として世界中で凌ぎが削られている。

　本研究では、更に高次の制御である、染色体の広い範囲のクロマチン構造を制御するメカニズムを明らかにすることを目的としている。染色体の広い範囲の領域制御機構の解明に関しては、世界的に見てもほとんど進んでおらず、制御機構を説明しうる新たな概念の確立が待たれている状態であった。それでも、染色体上の領域を制御する機構の研究は1991年以降、ある種のDNA配列をエンハンサーやサイレンサーと標的遺伝子の間に挿入することで、それぞれの影響が遮断されるという解析から進められている。この特殊なDNAエレメントはインシュレーターと呼ばれ、塩基配列の異なる複数のインシュレーターが同定されている。このように、エンハンサーやサイレンサーの活性を遮断するという解析系で研究が行われたことにより、染色体領域形成機構に関しては、DNAエレメント上に壁のような境界を形成する固定された境界「Fixed border」を想定するモデルが主流となっている。しかしながら、このようなモデルではPosition Effect Variegationで見られるような、遺伝型が同一な細胞群内で異なる位置効果が現れるといった変動的な領域形成等、説明できない現象が存在する。そこで、我々は、テロメア領域での研究により、染色体領域制御機構に対して、染色体上の機能領域を区別する境界が2種類の相異なる修飾酵素の同一基質部位に対するせめぎあいを介して生まれるといった新しいモデル(Negotiable border model)を提唱するにいたっている。本研究は、テロメアとは異なる領域であるHMR locusにおいてNegotiable border modelを検証することで、モデルの普遍性を示すと共に、HMR locusに含まれるtRNA遺伝子領域付近の領域制御機構に関しても解析を進めることでモデルの多様性をも検証したものである。

　本研究室のテロメア領域における解析より、転写活性化領域ではヒストンアセチル化酵素Sas2pによってヒストンH4のN末端から16番目のリジン(H4-K16)が高アセチル化状態に保たれ、転写不活性化領域では逆にヒストン脱アセチル化酵素Sir2pによってH4-K16が低アセチル化状態に保たれていること、これら染色体機能領域間に存在する境界領域は、Sas2p，Sir2pのバランスの保たれる領域において形成されていることを明らかにしている。また、Sir2pによって低アセチル化状態が維持されている領域には、ヒストンテイルの低アセチル化状態を認識してヒストンに結合することが知られているヘテロクロマチンを形成する因子Sir3pが局在することも明らかにしている。

　本研究では、転写に関与するRNAポリメラーゼの種類に注目すると、出芽酵母のサイレンシング領域が、RNAポリメラーゼII系のテロメア領域、RNAポリメラーゼII，III系のHM loci、RNAポリメラーゼI，III系のrDNA領域というように制御の機構を分類することが可能であると考えている。そこで、テロメア領域において明らかにしたRNAポリメラーゼII系の領域形成機構の普遍性の検証と同時に、RNAポリメラーゼII，III系の染色体領域制御機構の関係性も検証可能な領域として、出芽酵母の性遺伝子座HM lociの一つの領域であるHMR locusを選び、解析を進めている。HMR locusでは、サイレンサーEとIとの間に挟まれ転写不活性化制御を受けているa1，a2遺伝子を含む領域は、Sir2pによってH4-K16低アセチル化及びSir3pの高局在が維持され、それ以外の転写活性化領域はSas2pによってH4-K16高アセチル化及びSir3pの低局在が維持されていることが予想された。また、これら機能領域の間の境界領域がサイレンサーEとIの外側にそれぞれ一箇所の合計二箇所存在し、Sas2p，Sir2pのせめぎあいによって制御されていることが予想された。こういった予想を検証するため、H4-K16Ac及びSir3pの局在をクロマチン免疫沈降法(ChIP)によって解析し、転写活性の変化をmRNA発現量の測定によって解析している。H4-K16Acの局在に関しては、野生株とsas2，sir2欠損株との結果の比較により、Eサイレンサー側で見出した境界に関しては、Sas2p，Sir2p活性のせめぎ合いによってH4-K16Acの局在が規定されていることを明らかにした。Sir3pの局在に関しては、野生株及びsir2欠損株では、H4-K16が低アセチル化状態となっている領域にSir3pが高局在するといった相関性が見られ、H4-K16Acの局在に対応してSir3pの局在が規定されることを示している。しかしながら、sas2欠損株では、HMR locus全領域においてH4-K16が低アセチル化状態となるにもかかわらずSir3Pの局在が全体的に低下するという結果となった。この現象は、sas2欠損によってゲノムの全領域が低アセチル化状態となりテロメア領域等にSir3pが取られてしまい、HMR locusにおけるSir3pの絶対量が不足して起こっていることが理由なのではないかと考察した。Sir3pの大量発現株においてはHML locusでもSir3pの高局在が見られるという考察を支持する予備的な実験結果も得ている。Iサイレンサー側の境界に関しては、tRNA遺伝子付近に存在することが示されたが、tRNA遺伝子領域における低アセチル化及びSir3pの高局在がSir2pに依存せず維持されることより、Sas2、Sir2の組み合わせでは説明できない未知の領域制御が存在することも明らかにしている。次に、H4-K16Acの局在がHMR locusにおいて、遺伝子発現レベルと関連しているかを検討している。HMR locusにおける個々の遺伝子からのmRNA発現量を、野生株と各種変異株間で定量RT-PCRで測定した結果、HMR locusではテロメア領域同様、Sas2p，Sir2pによって形成されるH4-K16Acの局在に対応して遺伝子発現が規定されていることを明らかにしている。

　以上の解析を通して、Eサイレンサー側の境界に関して、染色体機能領域を形成する各要素がSas2p，Sir2pの活性のバランスによって制御されていることを示し、HMR IocusにおいてもNegotiable border modelが適用可能であることを示した。

　本研究では、tRNA遺伝子領域がIサイレンサー側の境界領域を形成していることを明らかにしているが、このSas2，Sir2の組み合わせによるNegotiable border modelだけでは説明できない染色体領域形成機構の存在することは、転写に関与するRNAポリメラーゼの種類によって染色体領域制御機構が分類されるとした仮説を支持するとして注目している。その上で、tRNA遺伝子領域の領域形成製機構の分子メカニズムの解析を、いくつかの可能性を検証する形で進めている。第一に、このtRNA遺伝子領域で検出されたH4-K16低アセチル化の要因が、ヒストンが局在していないからだという可能性に関して検証している。tRNA遺伝子領域におけるヒストンの局在をヒストンH3，H4に対するChIPによって検証し、十分な量のヒストンが局在していることを示したことで、この可能性に関しては否定している。第二に、Sir2p以外のヒストン脱アセチル化酵素が関与している可能性を検証している。出芽酵母に存在する全てのヒストン脱アセチル化酵素とSIR2との二重欠損体のtRNA遺伝子領域におけるアセチル化局在を解析し、低アセチル化状態を解除する組み合わせが無いかどうかを検証したが、該当するものはなかったことより、この可能性に関しても否定している。最後に、H4-K16部位以外でのヒストン化学修飾による制御の可能性を検討している。tRNA遺伝子領域で見られたSir3pの高局在に関して、ヒストンの様々な化学修飾部位に対する点変異株でその局在に影響を与えるものがないかSir3pに対するChIPにより解析したところ、Sir3pの局在に影響を与えるヒストン化学修飾部位を複数検出している。新たに見つかった化学修飾部位には、これまでサイレンシング制御への関与が知られていなかったものも多数含まれていた。この結果によって、H4-K16以外の新しい化学修飾部位によってtRNA遺伝子領域の機能領域形成が制御されていることを考察している。

　本研究においてNegotiable border modelがテロメア領域以外の領域にも適用可能なことを示したことによって、モデルの普遍性を示している。このことより、染色体の広い領域における高次の制御機構を説明するNegotiable border modelを確立することができた。また、tRNA遺伝子領域の領域形成機構に関しては、世界的に見ても、クロマチン構造変換との関連性を示唆する結果を得たのは初めての例である。こういった結果は、RNAポリメラーゼの分化と染色体領域制御機構の分化との進化的な関係といった、今迄誰も考えていなかった事象の解明へとつながる研究になったと考えられる。これらのことより本研究に関して、学位(薬学)に十分値すると判断した。