A variety of non-viral polymeric gene vectors have received much attention in the past decade (1) for the delivery of genetic materials to the targeted cells in an effective and safe manner. Especially, the polyplexes formed by the electrostatic interaction between plasmid DNA (pDNA) and polycations have been designed to condense pDNA, protect pDNA from rapid nucleolytic degradation, and facilitate its cellular uptake in order to achieve effective gene delivery. One of the advantages of polyplex systems is the possibility of various structural modifications to improve the stability and transfection efficiency of the polyplexes. Among such modifications, PEGylation [modification with poly(ethylene glycol)(PEG)] of polycations is a promising way to realize systemic gene delivery due to the improved stability of polyplexes in biological media (2). A typical PEGylated polyplex is a core-shell type polyplex (polyplex micelle). Polyplex micelles have been demonstrated to show high colloidal stability under biological media and substantial transfection activity against various cells even after preincubation with serum proteins.

The chemical structures of polycations in block copolymers substantially affect the capability of polyplexes as efficient gene vectors. In this regard, the development of highly transfectable but remarkably low cytotoxic PEG-block-polycation copolymers was recently reported (3), which are PEG-b-poly(N-substituted asparagine) copolymers having the N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl group in the side chain (PEG-b-P[Asp(DET)]) (Figure). Polyplex micelles from PEG-b-P[Asp(DET)] showed efficient and non-toxic transfection which motivated further clarification of the effects of PEGylation and the chemical structures of polyasparagine-based polyplexes on their transfection and cytotoxic behaviors. For this purpose, the comparative study were carried out with two types of polyasparagine-based polycations having a subtle difference in the number of methylene units in the side chain: N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl group (P[Asp(DET)]) and N-(3-aminopropyl)-3-aminopropyl group (P[Asp(DPT)]). Furthermore, to explore the effect of PEGylation on polyplex behavior, two types of PEG-b-cationic polyasparagines, PEG-b-P[Asp(DET)] and PEG-b-P[Asp(DPT)], were prepared (Figure) for the construction of polyplex micelles. As an evaluation model, multicellular tumor spheroid (MCTS) is focused on this study because it is known to be very useful three-dimensional in vitro tumor model, representing morphological and functional features of in vivo avascular solid tumors, and because they are characterized by prolonged viable spans with actively proliferating outer cell layers (4).

The protonation behaviors which affect the transfection activities through buffering capacity are evaluated in Chapter 2. P[Asp(DET)] and PEG-b-P[Asp(DET)] showed pH sensitive protonational behaviors and were expected to show buffering capacities in endosome to increase their transfection efficiencies. P[Asp(DET)] and P[Asp(DPT)] polyplexes were prepared to elucidate the effect of chemical structures on the transfection. Also, their PEGylated block copolymers, PEG-b-P[Asp(DET)] and PEG-b-P[Asp(DPT)] formed each polyplex micelle. For the evaluation model, human hepatoma HuH-7 MCTS successfully reproduced heterogeneous tumoral microenvironments and elongated life span, which support its usefulness as an evaluation system.

The transfection activity and cytotoxicity of polyplexes and polyplex micelles were evaluated with MCTS as well as conventional monolayer culture cells in Chapter 3. Worth noting is that the prolonged viable span of MCTS allowed long-term evaluation of more than 10 days of the expression of transfected genes. The high sensitivity of HuH-7 MCTS against polyplex induced cytotoxicity resulted in the destruction of their structures as in the cases of linear/branch polyethylenimine and P[Asp(DPT)] polyplexes. P[Asp(DET)] polyplex and PEG-b-P[Asp(DET)] polyplex micelle showed high transfection efficiencies probably induced by their specific protonational behaviors. The different transfection activities between P[Asp(DET)] and P[Asp(DPT)] structure-based polyplexes indicate the significant role of chemical structures in the design of polymeric vectors. PEGylation of polyplexes affected various transfection behaviors of polyplexes. PEGylated polyplex micelles showed lower cytotoxicity at the same N/P ratios to their non-PEGylated polyplexes. Also, they showed delayed transfection which may be related to high stability of polyplex micelles required for effective in vivo use.

In Chapter 4, the possibility of gene delivery for overcoming the transport barriers in heterogeneous tumoral environments was examined with newly developed polyplex systems against HuH-7 in vitro. The heterogeneous environments of solid tumors can slow down the movement of molecules including oxygen and nutrients. Thus, the resultant hypoxia is recognized as a barrier for the delivery of therapeutic materials. PEG-b-P[Asp(DET)] polyplex micelles showed higher penetrability towards the quiescent center of MCTS than P[Asp(DET)] polyplexes in HuH-7 cell line. To confirm the result of penetration, the hypoxia-selective plasmid was constructed. The selectivity of hypoxia-inducible expression system was confirmed by the transfection of hypoxic tumor cells in the cores of MCTS. Polyplex micelles showed transgene expression in hypoxic inner region of HuH-7 MCTS. PEG-b-P[Asp(DET)] polyplex micelles showed different localization of transfected gene expression from P[Asp(DET)] polyplexes. PEGylation affected the physicochemical properties of polyplexes, which may induce the improved percolation towards heterogeneous cellular environment of solid tumors.

Encouraged at the results of in vitro MCTS, the penetration and transfection were evaluated with P[Asp(DET)] polyplex and PEG-b-P[Asp(DET)] polyplex micelle against human pancreatic adenocarcinoma BxPC3 MCTS and in vivo solid tumor in Chapter 5. The results were well agreed with the penetration and the distribution of transfection observed in MCTS models. PEG-b-P[Asp(DET)] polyplex micelle proved its high penetrability and effective transfection in BxPC3 solid tumor.

It is summarized that the well-designed polyplex micelles increase the transfection efficacy and the penetrability, and reduce cytotoxicity, as evaluated through in vitro MCTS model and in vivo solid tumor. Considering the barriers in tumoral environments for the therapeutic transports, the designed PEGylated polyplex in this study is expected to achieve successful treatment based on its low cytotoxicity, durable transfection as well as improved penetrability.

Figure. Chemical structures of polycations

近年、遺伝子治療への期待が高まる中、安全安心でかつ高い遺伝子導入効率を達成しうる非ウイルス型遺伝子ベクターの研究・開発に高い関心が寄せられている。通常このような研究を遂行するにあたり、細胞の単層培養を用いたin vitro実験によりベクターをスクリーニングにかけ、その中で効果が現れたものを、動物を用いたin vivo実験により効果を評価するという手法をとることが多い。しかしながら、単層培養と動物実験の結果には必ずしも相関があるわけではなく、in vitroでの最適な条件がin vivoでは全く効果がないということがしばしば起こる。本論文では、そのような研究遂行上の矛盾を解決すべく、単層培養よりも生理的な条件に近い多細胞がんスフェロイド培養を用いてベクターの評価を行っている。この多細胞がんスフェロイドシステムは、in vivo固形がんの形態的・機能的特徴と類似した三次元的に培養されたin vitroがんモデルであり、長期間にわたるベクターの評価を可能にしている。また、代表的な非ウイルス型遺伝子ベクターには、カチオン性脂質と遺伝子の複合体であるリポプレックスと、カチオン性ポリマーとの複合体であるポリプレックスがあり、特に後者のポリプレックスは、構成するポリマーに対して化学修飾が可能なことから様々な機能付与を試みる研究が盛んに行われている。本論文では、プラスミドDNA(pDNA)を内包するポリプレックスを構成するポリマーのカチオン構造について、ポリアスパラギン酸(P(Asp))側鎖にN(2-aminoethyl)-2-aminoethyl基を導入したP[Asp(DET)]とN(3-amino propyl)-3-aminopropyl基を導入したP[Asp(DPT)]の比較検討を行い、さらに生体適合性のポリエチレングリコール(PEG)とのブロック共重合体であるPEG-block-P[Asp(DET)]とPEG-blockP[Asp(DPT)]から形成されるポリプレックスミセルに関して、そのPEG化の効果を検討している。前述のスフェロイド培養をin vivo実験の代替評価系として、ポリプレックスの安定性、生体適合性、腫瘍組織浸透性、遺伝子導入効率を評価し、その結果を踏まえて実際にin vivo腫瘍での評価を行っている。以下、各章ごとに、本論文の審査結果の概要を述べる。

第一章の序論では、遺伝子治療の現状と問題点に言及し、ポリプレックスとポリプレックスミセルの特性に関して述べ、in vivoの状況をより忠実に反映するin vitro評価システムが必要であること、その候補として多細胞がんスフェロイドがあることを述べている。

第二章では、ポリマーの物性と、pDNAと形成するポリプレックスの物性、またポリプレックスの評価に用いる多細胞がんスフェロイドの性質について述べている。一般的にポリプレックスが高い遺伝子導入効率を達成するには、エンドソームを脱出するためのバッファー機能が必要と考えられているが、本論文でベクターとして位置付けたP[Asp(DET2)]とPEG-b-P[Asp(DET)]に関してもpHに応答するポリマーのプロトン化を示し、バッファー機能が備わっていることを見出している。また、ヒト肝がん細胞HuH-7を用いて均一かつ長期間培養可能な多細胞がんスフェロイドの作製に成功し、in vivo評価へ移行する前のポリプレックスの評価システムとしての有用性を示している。

第三章では、ポリプレックス及びポリプレックスミセルの遺伝子導入効率と毒性について、単層培養系とスフェロイド培養系を用いて比較評価を行っている。単層培養系では2日間までしか遺伝子発現の評価が出来ないのに対し、スフェロイド培養系では10日以上評価することが可能であることを明らかにしている。また、多細胞がんスフェロイドはポリプレックスの毒性に対して非常に敏感で、市販の遺伝子導入試薬であるポリエチレンィミンやP[Asp(DPT)]を用いた場合、多細胞がんスフェロイドは崩壊することを指摘している。これに対してP[Asp(DET)]の毒性は非常に低く、同時に高い遺伝子導入効率を達成していることを見出すと共に、その要因としてP[Asp(DET)]の特異的なプロトン化能力を挙げている。また、ポリプレックスのPEG化は著しい毒性の低下をもたらし、遺伝子発現の遅延をも引き起こすことを見いだしている。これらの結果はPEG化によるポリプレックスの毒性の軽減と安定性の向上効果を示すものであり、inv ivo応用を考える上で非常に重要であるものと考えられる。

第四章では、低酸素状態に陥ったがん細胞に対する遺伝子導入について検討している。不均一な環境下にある固形がんでは、酸素や栄養などの物質の供給が遅く、部分的に低酸素状態に陥ってしまい、制がん剤などのデリバリー効率も非常に低いことが知られている。このよう疾患部位ヘベクターを到達させるには、ベクターの組織浸透性が重要となってくる。本論文では、スフェロイド培養系を用いた実験より、PEG-b-P[Asp(DET)】ポリプレックスミセルがPEG化により多細胞がんスフェロイドのより深部にまで到達できることを見出している。また遺伝子発現においても、PEG-b-P[Asp(DET)】ポリプレックスミセルとP[Asp(DET)]ポリプレックスでは、異なる位置で発現することを確認している。実際に、低酸素状態のみで発現するpDNAを用いてPEG-b-P[Asp(DET)]ポリプレックスミセルを評価したところ、多細胞がんスフェロイドの深部の低酸素部位特異的に発現させることに成功している。

第五章では、これまでのin vitroでの結果を元に、ヒト膵臓がんBxPC3胆がんマウスへの腫瘍内投与によりP[Asp(DET)]とPEG-b-P[Asp(DET)]の組織浸透性と遺伝子発現評価を行うとともに、その前段階としてBxPC3スフェロイドを用いて評価を行っている。In vivoモデルに対して行った実験結果は、スフェロイドに対して行った実験結果と良く一致しており、スフェロイドモデルの有用性と、PEG-b-P[Asp(DET)]ポリプレックスミセルのin vivoでの遺伝子ベクターとしての可能性を示す結果となっている。

以上のように本論文では、in vitroスフェロイドモデルおよびin vivo固形がんモデルを用いて、精密にデザインされたポリプレックスミセルが、高い遺伝子導入効率と優れた組織浸透性を示し、毒性を著しく軽減させることを見出している。本論文の内容は、その独創的なアプローチや高い有用性から考えて医工融合の分野において極めて秀逸であり、展開される分子設計論は新しいバイオマテリアルにつながる重要な知見を提供しうるものと判断される。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。