【背景】

胚性幹(embryonic stem, ES)細胞は哺乳類初期胚の内部細胞塊に由来し、あらゆる種類の細胞へと分化する能力(多能性)をもち、未分化な状態を維持したまま長期にわたって培養することができる。これまでの研究により、ES細胞から様々な細胞を特異的に分化させる培養系が開発された。このような分化系は、胚発生における細胞の分化誘導や特異化の制御機構を研究するための培養モデル系として有用である。とりわけES細胞から膵臓の細胞を誘導する培養系は、将来の糖尿病患者に対する再生医療への応用だけでなく、膵臓発生機構解析のための分化モデルや医薬品候補化合物の評価系としても期待されている。

ES細胞を分化させる一般的な方法として、胚様体と呼ばれる細胞塊を形成させる方法、他の細胞と共培養する方法、および単層培養系で分化させる方法が知られている。細胞塊の形成は分化に必要な細胞間相互作用を促進させる反面、特定の細胞のみを誘導する場合には、細胞塊内部の細胞の不均一性が障害となる。これに対して、単層培養系での分化は隣接する細胞による影響が少なく、各細胞を比較的均一な条件下で分化させることが可能である。また多くの分化誘導法は、成長因子や誘導因子の供給源としてウシ胎児血清(FBS)を使用してきた。しかし血清の使用にはロットごとの差異や同定されていない多くの誘導因子が含まれる等の深刻な欠点があり、近年、血清を使用せずに特異的な分化に必要な因子を同定する試みが始まっている。

本研究において、私はマウスES細胞から膵臓の細胞を高効率に誘導する新しい培養系の確立を目的とし、異なる特徴をもった2つの培養系を開発した。まず、私は膵臓発生機構の解析に利用可能な分化誘導系を構築するため、膵臓発生に必須の因子であるレチノイン酸とアクチビンを用いて、ES細胞の細胞塊から外分泌細胞、導管、内分泌細胞をすべて含む膵臓様組織を分化させる培養系を開発した(Nakanishi et al., 2007)(第一章)。次に、より安定で高効率な膵臓分化誘導系へと発展させるため、膵臓の前駆細胞が含まれる内胚葉に着目し、マウスES細胞を、無血清培地中で単層培養し、内胚葉の細胞を誘導する方法を開発した。このような膵臓の前駆細胞を高純度で取得できれば、より均一な膵臓組織の誘導が可能になると考えられる(第二章)。

【第1部マウスES細胞から膵臓様組織を分化誘導する培養系の開発】

膵臓は、マウスの発生過程において初期内胚葉の前方領域に由来する。膵臓を構成する各細胞(消化酵素を分泌する外分泌細胞、消化酵素を十二指腸へと導く導管、ホルモンを分泌する内分泌細胞)は、すべて共通の前駆細胞から分化すると考えられている。これまで培養系でES細胞から膵臓の細胞を誘導した報告は、いずれも内分泌細胞にのみ注目しており、膵臓組織全体を誘導するものではなかった。しかも、膵臓では発現しない神経マーカー陽性細胞を使用する極めて人工的な方法であり、膵臓発生のモデル系としては不適切であった。

私はES細胞のコロニーを剥離して形成した細胞塊を、血清代替物とレチノイン酸・アクチビンを添加した無血清培地中で培養して分化誘導した。レチノイン酸・アクチビン処理によって、ES細胞塊における初期内胚葉マーカー遺伝子および膵臓外分泌細胞、導管、内分泌細胞の各マーカー遺伝子発現量が著しく増加する一方、膵臓で発現が抑制される遺伝子Sonic hedgehog の発現は減少した。免疫組織化学的な解析により、処理したES細胞塊においてアミラーゼ陽性の細胞、インスリンまたはグルカゴン陽性細胞、および導管様構造の形成が観察された。電子顕微鏡を用いた解析により、これらの細胞内には多量の顆粒が存在するなど、その微細構造は膵臓外分泌細胞、内分泌細胞および導管細胞の特徴と一致することが確認された。これらの結果は、レチノイン酸・アクチビン処理したES細胞から外分泌細胞、導管、内分泌細胞をすべて含む組織が誘導されたことを示唆する。

次にレチノイン酸およびアクチビンによる膵臓分化誘導の濃度依存性を、定量的RT-PCR法および免疫染色によって検討した。0.1 μMのレチノイン酸存在下において、低濃度(10 ng/ml)アクチビンとの共処理はアミラーゼ陽性細胞を増加させ、より高濃度(25 ng/ml)のアクチビンとの共処理はインスリン陽性細胞を増加させた。したがって、アクチビンの処理濃度が、本実験系における外分泌細胞と内分泌細胞の誘導を調節していると考えられる。

レチノイン酸・アクチビン共処理による膵臓組織の誘導効率を検討した結果、0.1 μMレチノイン酸および25 ng/mlアクチビンによる分化誘導の結果、膵臓分化マーカーPdx1の発現が検出されるES細胞塊の割合は43 %であり、30 %の細胞塊でインスリン陽性細胞が観察された。また、インスリン陽性細胞が観察された細胞塊に占めるインスリン産生細胞の割合は, 5.0 % であった。

本研究は、マウスES細胞を用いて試験管内で、膵臓外分泌細胞、導管、内分泌細胞をすべて含む組織を分化誘導した初めての報告である。この実験系において、レチノイン酸とアクチビンが顕著な膵臓分化誘導能を持つ一方、誘導された組織は膵細胞以外の様々な細胞を含む不均一な細胞から構成されていることが示唆された。

【第2部マウスES細胞から内胚葉の細胞を誘導する系の開発】

次に、より安定で高効率な膵臓分化誘導系へと発展させるため、私は膵臓の前駆細胞が含まれる内胚葉に着目した。膵臓は、マウスの発生過程において初期内胚葉の前方領域に由来する。内胚葉は原腸陥入の際に中胚葉とともに原条(primitive streak: PS)から形成される。PS発生の分子機構については未解明な部分が多いが、変異マウスをもちいた近年の研究の結果、WntシグナルとTGF-βシグナルがPSの発生に不可欠であることが示唆されている。本研究で私は、成分既知の無血清培地を使用して、 単層培養したES細胞から内胚葉の細胞を誘導する新しい方法を開発した。

Wnt-3aによるES細胞からのPS誘導 最初に、WntシグナルとアクチビンシグナルがES細胞のPS分化に与える影響を調べた。Wnt-3aとアクチビン(ともに5-50 ng/ml)を添加した無血清培地中で単層培養したES細胞ではbrachyuryやgoosecoidなどのPSのマーカー遺伝子発現量が特異的に上昇した。特にWnt-3aで処理した細胞では発現量の上昇が著しく、免疫染色でも80 % の細胞がbrachyury陽性であった。さらに、Wnt-3a処理した細胞から細胞塊を形成させ、血清を含む培地中で培養した結果、PS以外に由来する神経細胞へと分化する割合が、未分化のES細胞から形成させた細胞塊と比較して有意に低下した。この結果は、Wnt-3a処理がES細胞をPSへと誘導し、それ以外の細胞系譜への分化能を制限した事を示唆する。

レチノイン酸およびアクチビンによるES細胞の内胚葉誘導 次に、ES細胞から内胚葉の細胞を選択的に誘導するため、3日間50 ng/ml Wnt-3a存在下で培養した細胞を様々な培養条件で培養した。初期内胚葉分化マーカー遺伝子Sox17および内胚葉前方マーカー遺伝子Onecut1等の発現量を指標として検討をおこなったところ、先行研究において内胚葉誘導を促進することが報告されていたアクチビンを添加しても内胚葉マーカーの発現量は上昇しなかったが、レチノイン酸を添加すると内胚葉マーカーの発現量が顕著に上昇した。さらに、レチノイン酸とアクチビンを共処理した場合、Sox17の発現は相乗的に促進された。免疫染色の結果、1 μMレチノイン酸と10 ng/mlアクチビン処理開始2日後、Sox17とOnecut1が、ES細胞の11 %および25%で検出され、一方PSと中胚葉の分化マーカーであるbrachyury陽性細胞は大幅に減少した。これらの結果は、レチノイン酸とアクチビンがPSから内胚葉への選択的な分化を促進した事を示唆する。

本実験系は細胞塊形成や他の細胞との共培養、遺伝子導入等をもちいずに、無血清培地において内胚葉の細胞を誘導した新しい方法である。誘導された細胞が内胚葉組織を形成する分化能をもつかは現在検討中だが、この培養系はWnt-3aおよびレチノイン酸・アクチビンの膵臓発生機構における役割の解析のために有用なモデルとなる可能性がある。さらに、本研究の成果は膵臓内分泌細胞のような医療にとって有用な内胚葉性組織をES細胞から産生するための重要な過程となると思われる。

生物の発生過程における膵臓形成について研究するために、これまでは遺伝子変異動物や膵臓の初代培養を利用して研究がおこなわれてきた。しかし、遺伝子変異動物をもちいた解析は膵臓発生を制御する未知の因子の探索や大規模な評価には適さず、また初代培養は安定した分離や長期間の培養が難しく再現性の高い実験結果を得るのは困難だった。胚性幹細胞(ES細胞)は、体を構成するほぼ全ての細胞へと分化する能力(多能性)をもち、この能力を維持したまま無制限に培養を続けることが可能である。これまでにES細胞から試験管内で様々な種類の細胞を分化させる培養法が研究されている。

もし試験管内でES細胞を膵臓へと分化させることができれば、遺伝子変異動物より時間的コストがかからず、また初代培養よりも安定的に、膵臓発生を制御する因子を効率良く探索・評価することが期待できる。さらに、試験管内で誘導された膵臓の細胞は、医薬品開発や再生医療へと応用することも期待される。そこで論文提出者は、試験管内でES細胞の膵臓分化を誘導する培養法の開発を目的として、研究を行なった。

最初に、ES細胞塊を利用した膵臓組織誘導法の検討について述べられている。ES細胞のコロニーを剥離して形成させた細胞塊を浮遊培養した結果、外胚葉、中胚葉、および膵臓へと分化する内胚葉の各分化マーカーの発現上昇がみとめられた。続いて、カエルの未分化細胞であるアニマルキャップを膵臓に分化させた先行研究をふまえ、レチノイン酸とアクチビンがES細胞の膵臓分化に与える影響を検討した。内胚葉分化マーカーSox17が発現する形成後4日目の細胞塊を2日間、0.1 μMレチノイン酸と10 ng/mlアクチビンのいずれか、あるいは両方を添加した培地中で処理した後、細胞塊を培養皿に接着させて培養を続けた。処理後の三胚葉と膵臓の各分化マーカーの発現をRT-PCR法によって調べた結果、外胚葉および中胚葉マーカーの発現に処理による差はみられなかったの対し、内胚葉マーカーSox17、膵臓内分泌細胞マーカーInsulin、Glucagon、Pancreatic polypeptide、Somatostatinおよび膵臓外分泌細胞マーカーAmylase 2の発現はレチノイン酸・アクチビン共処理による顕著な上昇がみられた。また組織学的な解析により、レチノイン酸・アクチビン共処理した細胞塊の内部において、内分泌細胞マーカーInsulin陽性、Glucagon陽性、あるいは外分泌細胞マーカーAmylase陽性の細胞が観察され、さらに上皮細胞によって形成された膵臓導管様の構造もみとめられた。

次いで、レチノイン酸・アクチビンの処理濃度が膵臓分化誘導に与える影響について述べられている。各濃度のレチノイン酸(0, 0.1 または 1 μM)およびアクチビン(0, 10または 25 ng/ml)で処理したES細胞塊における膵臓マーカーの発現を定量的RT-PCR法と免疫染色によって検討した結果、レチノイン酸のみで処理した細胞塊において、膵臓マーカーの発現量は無処理の細胞塊より増加したが、アクチビンのみで処理した細胞塊では変化がなかった。また、レチノイン酸濃度は一定(0.1 μM)でアクチビン濃度を変化させた場合、低濃度(10 ng/ml)アクチビンとの共処理は外分泌細胞を,より高濃度(25 ng/ml)のアクチビンとの共処理は,内分泌細胞を著しく増加させた。この結果はアクチビンの処理濃度が、本実験系における外分泌細胞と内分泌細胞の誘導を調節していることを示している。

次いで、本培養系における膵臓組織の誘導効率について述べられている。各細胞塊における膵臓分化マーカーPdx-1の発現をRT-PCR法によって調べた結果、0.1 μM レチノイン酸・25 ng/ml アクチビン共処理した細胞塊の43%でPdx-1発現が検出された。さらにインスリン陽性細胞の誘導効率を免疫染色により調べた結果、30%の細胞塊でインスリン陽性細胞がみとめられ、各細胞塊に占めるインスリン陽性領域の割合は平均で5%であった。これらの結果は、レチノイン酸とアクチビンがES細胞の膵臓分化を明らかに誘導する一方、細胞塊には膵臓以外の細胞も多く含まれることを示している。

そこで論文提出者は次に、膵臓発生の各過程の制御因子をさらに詳細に探索・評価するため、細胞塊形成の影響を排した新しいアプローチで、膵臓を分化誘導することを目的に研究を行なった。細胞塊を形成させると細胞間相互作用により分化が誘導される反面、得られる分化誘導作用は同定・制御が困難であるため、分化過程解析の妨げとなった。また、細胞塊には分化状態の異なる様々な細胞が含まれ、これが膵臓以外の細胞への意図しない分化の原因となると考えられた。このような問題点を克服するため、論文提出者はES細胞を無血清・成分既知の培地(ESF培地)中で、単層培養して分化させることを考えた。これにより、細胞間相互作用や培地中の未知の成長因子の影響を減らし、各誘導因子が分化に与える影響を明瞭に解析することが期待できる。さらに各細胞の環境が均一であることから、ES細胞から中・内胚葉の前駆細胞である原条の細胞、原条の細胞から内胚葉へと分化誘導する培養条件を、各段階の分化状態を解析しながら検討することができ、結果として、より高効率に膵臓組織を誘導することが可能になると考えた。

まずES細胞を中胚葉と内胚葉の前駆細胞である原条の細胞へと分化させる条件検討について述べられている。遺伝子変異動物をもちいた先行研究により原条・内胚葉分化への関与が示唆されていたWnt-3aあるいはアクチビンを加えたESF培地中でES細胞を単層培養し、各分化マーカーの発現変化を定量的RT-PCR法によって調べた。その結果、Activinによる発現変動は僅かであったのに対し、50 ng/mlのWnt-3aにより、原条の細胞で強く発現するBrachyury、Foxa2、Goosecoidが処理開始3日目までに顕著に発現上昇する一方、外胚葉の分化マーカーSox1の発現はES細胞よりも減少した。免疫染色により原条の細胞の誘導効率を調べた結果、50 ng/mlのWnt-3aで3日間処理したES細胞の61%がGoosecoid陽性で、80%がBrachyury陽性であった。

生体の発生において、原条に含まれない細胞は外胚葉を形成し、神経や表皮へと分化する。したがって、ES細胞が原条の細胞へと分化すれば、同時に外胚葉由来の神経などへ分化する細胞は減少することが予想される。そこで、ES細胞を50 ng/ml Wnt-3aで3日間処理後、先行研究を参考に血清存在下で細胞塊を形成させる方法で神経分化を誘導し、Wnt-3a処理による神経誘導効率の変化を調べた。その結果、未分化なES細胞からは63%で神経マーカーβ3tubulin陽性細胞が誘導されたのに対し、Wnt-3a処理後の細胞では27%に減少した。

Wnt-3a処理時の各細胞内シグナル伝達経路の活性化状態を調べた結果、Wnt canonical経路の活性化(GSK3のリン酸化状態低下と細胞内β-catenin量の増加)がみられた。

次いで、Wnt-3aによって原条の細胞へと分化したES細胞を、膵臓の前駆細胞を含む内胚葉へとさらに分化させる方法の検討について述べられている。50 ng/ml Wnt-3a存在下で3日間培養した細胞を、レチノイン酸(0, 0.25, 1または5 μM)とアクチビン(0, 5, 25または100 ng/ml)存在下でさらに2日間培養し各マーカー遺伝子の発現変化を調べた。その結果、アクチビンのみの処理では内胚葉初期分化マーカーSox17の発現に変化はみられなかったが、レチノイン酸と共処理することによって、発現量が相乗的に増加した。原条の細胞からは内胚葉と中胚葉が分化するが、原条と中胚葉の分化マーカーBrachyuryの発現量は処理後、著しく減少し、中胚葉に由来する血管や筋肉の分化マーカー発現にも大きな変化はみられなかった。免疫染色の結果、Brachyury陽性細胞はレチノイン酸・アクチビン処理によって79%から3%に減少した一方、内胚葉で発現するOnecut1およびSox17の陽性細胞は、レチノイン酸・アクチビン処理前は検出されなかったのに対して、処理後それぞれ全細胞の23%および11%で発現が検出された。さらに、膵臓の初期分化マーカーPdx1の発現にも処理による顕著な上昇がみられた。

以上の結果をまとめると、本研究では、試験管内でマウスES細胞から膵臓組織を分化誘導することを目的とし、アプローチの異なる2つの培養系を開発した。第1の培養系はES細胞塊をレチノイン酸・アクチビン共処理し、培養系で膵臓の内分泌細胞だけでなく、外分泌細胞と導管構造をすべて含んだ組織を誘導することに初めて成功した。第2の培養系は、膵臓の前駆細胞をふくむ内胚葉の細胞を成分既知の培地中で、しかも細胞塊形成を経ずに初めて誘導した。従来の遺伝子変異動物をもちいた研究の結果からでは、膵臓発生のどの過程にどの成長因子が必要であるか詳細は不明であったが、この系においてWnt-3aが原条の細胞への分化を、レチノイン酸・アクチビンが原条の細胞から内胚葉への分化を誘導することが示された。特にレチノイン酸の初期内胚葉分化への関与についてはこれまで報告されておらず、初期内胚葉分化のレチノイン酸シグナルによる制御を示唆する新たな知見である。

従って、本審査委員会は博士(学術)の学位を授与するにふさわしいものと認定する。