Changing the biofuoling nature of polymeric substrates which are commonly used for fabrication of microchip devices is of an hugely important issue to be addressed since the microchip devices have been extensively researched and widely used in many application in handling biological entities such as DNA separation, immunoassay, cell sorting, biosensors and enzymatic assays due to the potential offered by miniaturizing including high throughput of analysis, low cost of fabrication, multiplex functionality, and portability. The higher surface-to-volume ratio in the devices, the more the surfaces is available for interacting with biomolecules. The nonspecific protein and cell adsorption is one of the common problem in them need to be eliminated. Therefore, I took the concept of cell-membrane-biomimicry interface based on phospholipid to be created on the polymeric substrates by taking two approach which are by coating with MPC copolymers and brush type poly(MPC).

Firstly, I demonstrated the construction of the nonbiofouling interface by one- step-simple dip coating process using poly(2-methacryloyloxylethyl phosphorylcholine(MPC)-co-n-butyl methacrylate)(PMB) and poly(MPC-co-2-ethylhexyl methacrylate-co-2-(dimethyamino)ethyl methacrylate) (PMED). The amphiphilic MPC copolymers anchored strongly on the substrates and provided excellent nonspecific protein adsorption resistance. The hydrophilic property and the surface mobility of the modified surfaces were greatly improved compared to the unmodified ones. In term of surface charge, the MPC copolymers assure the ζ-potential to the zero level. The protein adsorption on the polymer materials with and without the surface modification was evaluated using a protein mixture of human plasma fibrinogen and serum albumin and the reduction of the nonspecific protein adsorption was excellently improved ranging form 56% to 90% to the level of 0.2 g/cm2. This generic modification can be a promising method for improving protein resistant property of hydrophobic substrates. Furthermore, by choosing the good solvent, surface modification of PDMS substrate by both copolymers can be successfully conducted. Moreover, the PMED is more effective for modification of PDMS substrate.

Secondly, I studied another versatile approach to prepare nonbiofouling surface bearing brush type poly(MPC) on polymeric substrates based on surface-initiated living radical graft polymerization with keeping in mind that this type of surface could repress nonspecific protein adsorption to the nano level (ng/cm2). Thus, macrophotoiniferter composed of ethyl hexyl methacrylate (EHMA) and vinyl benzyl N,N`-diethyldithiocarbamate (VBDC) was synthesized. The chain density was controlled by changing the composition of N,N`-ditethyldithiocarbamate on the photomacrophotoiniferter while the chain length was controlled by changing photoirradiation time. The characterization of the poly(MPC) modified surfaces was conducted by static and dynamic water contact angle, x-ray spectroscopy (XPS), ATR-IR, atomic force microscope (AFM), and ellipsometry. The nonspecific protein adsorption test was conducted by contacting with single protein solutions and binary protein solution of fibrinogen and albumin and the amount of adsorbed protein was determined by using micro BCA method. The dry thickness and molecular weight of poly(MPC) grafted on the surfaces increased according to photoirradiation time although the livingness of the process could only be maintained up to 1 hour photoirradiaition time. The hydrophilicity of the modified surfaces was greatly improved as both water static and dynamic contact angle showed very low contact angles due to the complete covering of the surface by poly(MPC) chains especially in the higher chain density (high composition of photoiniferter). The morphology of the surfaces varies depending on the photoirradiation time and chain density where the smooth surfaces were generally generated on medium chain density and chain length of poly(MPC). Total nonspecific protein adsorption was effectively suppressed on moderate to high poly(MPC) chains, moderate chain length and smooth surfaces to the level of 0.2 g/cm2. The mechanism of the protein adsorption from single solutions and binary solutions of fibrinogen and albumin was briefly studied based on the protein adsorption mechanism proposed by some group of researches.

This approach can also be applied for modification of many kinds of polymeric substrates although the compatibility of solvent to the macrophotoiniferter and substrates must be carefully taken into account.

The cell adhesion tests revealed that all the poly(MPC)-modified surfaces excellently inhibit cell adhesion of fibroblast-like cell (L929) assuring the nonbiofouling properties of the modified surfaces.

For application in microchip devices, modification of microfluidic devices for inhibiting nonspecific protein adsorption (biofouling) have been conducted by the two approaches; by simple coating with MPC copolymer (PMB and PMED) and by brush type poly(MPC). The simple coating method have offer a one step modification for PDMS-based microchannel device as the protein adsorption resistance was greatly improved. I found also that PMED was much more effective in covering the nature of PDMS. Further, nonbiofouling interface in PET-based microchannel was also created by constructiong brush type poly(MPC). The best conditions of modification in this microchannel were seemingly different with the ones in modification plat substrates due to the UV light intensity and the thickness of PET substrate. Thus, the best conditions for PET-based microchannel interface modification need to be addressed. Further, construction of micropatterned nonbiofouling and biorecognition interface can be done easily in ambient condition.

In the future, the mechanism of protein adsorption on the rough surface should be done in odder to get the clear insight of the fact that the nonspecific protein adsorption was still severe on the rough interface. Creating dual function surface which has nonbiofouling part and biorecognition part using the living radical polymerization based on dithiocarbamate can be easily conducted on the polymeric substrates. Therefore, the ability to perform immunoassay-based microarray biosensors (immunobiosensors) could be conducted and should be studied. The challenge to perform biosensors inside the microchannel also needs to be addressed.

免疫分析、細胞分離、遺伝子解析などの様微量のバイオ分子を分離・解析することが求められるナノバイオ分析応領域においてマイクロチップデバイスは、高スループットで、小型、集積化が可能などの利点をもつために大きな期待が集まっている。しかし、体積に比較して表面積の大きなマイクロチップを作製するポリマー材料の多くは、バイオ分子による汚染が起こり分離効率、分析感度の顕著な低下を引き起こすことが問題として指摘されている。そのため、バイオ汚染を極限まで低下することのできる表面を持つ新規なポリマー材料の創製が強く求められる。本研究論文は、リン脂質ポリマーを基盤とした細胞膜類似イオンターフェイスをポリマー材料へ構築する作製技術を確立し、そのプロセス技術をマイクロチップデバイスへ応用することを目的としている。具体的には、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)ポリマーをコーティング法および表面グラフト重合法によりポリマー基板に導入する手法を明確に示し、これを基礎としてバイオ分子をハイブリッドした高精度分子認識インターフェイスの構築について研究を行っている。

本学位請求論文は全体で5章から構成されている。

第1章では、バイオインターフェイスを作製するための基本技術を解説し、特にマイクロチップへの応用においてバイオ汚染抑制の重要性について述べている。また、このようなバイオインターフェイスを創製するための様々な手法、例えば自己組織化単分子膜や、グラフト重合法でブラシ状のポリマー鎖を創製する手法についてまとめている。またこの章では、バイオセンサーや免疫分析といったバイオ分子を利用するデバイスへの応用に向けて、バイオ分子を固定化できるマイクロパターニングの形成が重要となることについても述べている。

第2章では、poly(2-methacryloyloxylethyl phosphorylcholine(MPC)-co-n-butylmethacryl-ate)(PMB) とpoly(MPC-co-2-ethylhexyl methacrylate(EHMA)-co-2-N,N-dimethyaminoethyl- methacrylate)(PMED)を用いた一段階のディップコーティングプロセスにより、バイオ汚染を低減するポリマー表面創製についてまとめている。合成した両親媒性のMPCポリマーは、強くポリマー基板と結合して表面に固着し、タンパク質の吸着を抑制できることを示している。また、MPCポリマーで修飾した基板は、未修飾の基板と比べ、親水性と表面運動性が向上し、ゼータ電位がほぼゼロレベルまで低下することを示している。この汎用性に優れた表面修飾法は、疎水性ポリマー基板へのタンパク質非吸着耐性を向上させる有用な手法であることを確証している。さらに、マイクロチップデバイスに使用されているポリジメチルシロキサン(PDMS)基板の表面修飾においても、PMEDを用いて適した溶媒を選択することにより本修飾方法の有効性を見出している。

第3章では、表面からの精密重合を利用したMPCポリマーブラシの創製と非バイオ汚染特性についてまとめている。すなわち、タンパク質の吸着をナノレベル(ng/cm2)に抑制する可能性をもつブラシ状のMPCポリマーを、表面開始リビングラジカル重合法により創製している。マクロ光開始剤として、EHMA と 4-vinylbenzyl-N,N-diethyldithiocarbamate (VBDC)の共重合体を合成し、グラフト鎖密度と生成するMPCポリマー鎖長を、マクロ光開始剤のVBDC組成と光照射時間により制御している。表面の解析を原子間力顕微鏡観察により行い、ポリマー合成と表面の特性との関連について示している。また得られた表面に対するタンパク質の吸着試験を、アルブミン、フィブリノーゲンを用いて、単独系および混合系で行い評価している。混合溶液でのタンパク質の特異吸着量は、MPCポリマー鎖密度と長さに依存し、最適化により200 ng/cm2以下にまで低減できることを示している

第4章では、マイクロチップ内での表面創製について検討し、マイクロ流体デバイスに対してMPCポリマーのコーティング法とグラフト重合法を適用している。コーティング法は、PDMS製のマイクロ流体デバイスへワンステップで処理できる有用な手法であることを示し、タンパク質の吸着抑制に関しても、優れた改善効果が認められたことを述べている。ポリエチレンテレフタレートを基板材料とした場合には、グラフト重合法が適用でき、有効に機能発現することを確かめている。さらに、穏和な条件でバイオ分子を固定化できるユニットを導入したポリマーブラシの創製を行い、フォトマスクを利用するとマイクロパターン化もできることを示している。この表面に対してタンパク質をハイブリッドできることを明らかにし、タンパク質パターン固定に成功している。

第5章は、リン脂質ポリマーを用いたバイオ分子の吸着を低減したバイオインターフェイスの構築に対する総括である。タンパク質の吸着を抑制する解決策の提示と、選択的なタンパク質のハイブリッド形成によるマイクロアレイ型の免疫センサーや酵素センサーの作製の基盤技術として利用できると結論している。

本研究は、MPCポリマーのポリマー基板への修飾法として、簡便なコーティング法と、表面開始リビングラジカル重合法による精密なポリマーブラシ形成法について系統的に検討し、マイクロチップをバイオ分子の分離・解析デバイスとして使用する際の問題となるタンパク質吸着や細胞接着を抑制する解決策を明示している。ポリマーバイオマテリアルとその微細プロセッシング技術の確立により、今後のナノバイオ工学に不可欠なマイクロデバイスの発展に大きな貢献をもたらすものと評価できる。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認める。