Epigenetics is the mechanism to modulate gene expression in a reversible, heritable and dynamic manner without changing the DNA sequence. A central question in epigenetics is how the epigenetic marks are established and maintained in the genome. The aim of the present study was to characterize novel RNA-interacting molecules to examine their impacts on the epigenome. This study focused on the following two molecules, the SRA-RING protein Np95 (nuclear protein 95, also known as Uhrf1 and ICBP90) and the tudor/maternal tudor domain containing protein Ecat8 (ES cells specific transcript 8), because of their possible roles in epigenetics in mice. In this study, firstly, the author investigated the involvement of the SRA-RING protein Np95 in mammalian DNA methylation. Here, the author reports that Np95 interacts with Dnmt1 (DNA methyltransferase 1) and recruits Dnmt1 to the replicating heterochormatin. Furthermore, by using Np95 deficient stem cells and embryos, the author finds that Np95 is essential for global and local maintenance of DNA methylation, genomic imprinting and repression of retrotransposons. Secondly, in the present study; the author examined the role of the tudor-domain containing protein Ecat8 in regulation of RNAs and epigenetics in germ cells. The author shows that Ecat8 is essential for male fertility and expression of germ cell specific piRNAs (Piwi interacting RNAs) in the testis. Investigating the role for Ecat8 in germ cell epigenetics, the author found that a significant loss of DNA methylation in the IAP and LINE retroelements is observed in the Ecat8 knockout mice spermatogonia. Thus, the author shows a role for Ecat8 in epigenetics and regulation of piRNAs in mammalian germ cells that has not been reported before. In summary, this report suggests that RNA-associated proteins may have important functions in epigenetics and play crucial roles as master regulators of the epigenome.

エピジェネティクスとは、DNA塩基配列の変化を伴わない遺伝子発現調節のメカニズムである。エピジェネティクスの原因となるDNAメチル化やヒストン修飾などのクロマチンへの後天的な修飾は、世代を超えて継承され、あるいは、環境変化に対応して流動的に変化する。エピジェネティクスは、受精や個体の発生、細胞分化などの多様な生命現象や疾患における、遺伝子発現の調節に深く関係している。エピジェネティクス分子機序の一つであるDNAメチル化において、Dnmt酵素群(DNA methyl transferase: Dnmt1, Dnmt3a/3b)の役割が知られているが、その詳細なメカニズムは未解明である。本研究では、ES細胞(Embryonic stem cell)と生殖細胞に特異的に発現しているNp95(Nuclear protein 95、別名Uhrf1)とEcat8(Embryonic stem cell associated transcript 8、別名2410004F06Rik)に注目し、哺乳類の発生過程におけるエピジェネティクスにおいてこれらのタンパク質が担う役割を明らかにしたものである。

第一章は、本研究の目的や主な結果、考察を簡潔に記した要約である。

第二章においては、エピジェネティクスの定義や主な分子メカニズム、ゲノムインプリンティング(父親由来か母親由来かによって遺伝子発現に差異が認められる現象)やゲノム内在性のレトロトランスポゾン抑制におけるDNAメチル化の役割などを含め、本研究の背景を説明している。

第三章では、本研究に用いた試薬類やDNA/ RNA抽出法、mRNAの発現の定量法、DNAメチル化解析(バイサルファイト)法、多型マウスを用いたゲノムインプリンティング解析法、マウスの生殖細胞精製法、生殖細胞特異的なsmall RNA(piRNA: Piwi-interacting RNA)の同定法、用いたプライマー配列などの具体的な実験方法を述べている。

第四章においては、哺乳類のエピジェネティクスにおけるNp95の機能について述べている。本研究では、SET and RING finger-associated (SRA)ドメインを持つタンパク質Np95の機能を解析するために、Np95欠損型ES細胞およびマウスを作製している。Np95欠損型ES細胞においては、DNA修復機構の異常やセントロメア反復配列の転写活性化などが既に報告されており、また近年、植物においてSRAドメインを持つタンパク質VIM1がDNAメチル化に関与することが報告されていることから、哺乳類のエピジェネティクスにおいても、Np95が何らかの重要な役割を持つことが予想されている。本研究では、Np95欠損型マウスは胎生致死であることを発見し、胎児の発生にNp95が不可欠であることを示している。また、DNAメチル化におけるNp95の機能解析を行うため、メチル化DNA感受性の制限酵素(HhaI, HpaII)を用いてゲノムDNAを消化処理することにより、Np95欠損型ES細胞や胎児において、ゲノム全体的に深刻なDNA脱メチル化が起きていることを明らかにした。さらに、哺乳類のゲノムの約40%を占めているゲノム内在性のレトロトランスポゾン(IAP, LINE, SINEなど)は通常DNAメチル化によって発現が抑制されているが、Np95欠損型胎児においてはこれらのレトロトランスポゾンがすべて脱抑制(活性化)されており、これがNp95の欠損によって生じるDNA脱メチル化の影響であると結論づけている。さらに、DNAメチル化がゲノムインプリンティングに深く関係していることが知られているが、B6XJF1多型の胎児を用いた解析により、Np95欠損型胎児ではゲノムインプリンティング機構が崩壊していることを見出した。そこで、DNAメチル化とこれらの現象を直接結び付けるために、バイサルファイトDNAメチル化解析法を用いて、Np95欠損型ES細胞や胎児におけるDNAメチル化状態を解析し、その結果、全てのレトロトランスポゾン領域やインプリンティング遺伝子座でのDNA脱メチル化が起こっていることを明らかにした。さらに、様々なDnmt酵素欠損細胞(Dnmt1欠損, Dnmt3a/3b-ダブルノックアウト, Dnmt1/3a/3b-トリプルノックアウト)を用いた免疫染色解析により、細胞周期のS期にDnmt1タンパク質がNp95と共局在すること、また、免疫沈降解析により、Dnmt1がNp95タンパク複合体に存在することを示めしている。

第五章では、Ecat8欠損型マウスを用いて、哺乳類のエピジェネティクスにおけるEcat8の機能を解析している。Ecat8欠損型マウスにおいて、雌のマウスは正常であるが、雄のマウスには精巣の発生の異常が認められ、雄だけが不妊であることを明らかにしている。さらに、生殖細胞を用いたバイサルファイトDNAメチル化解析により、Ecat8欠損型の雄マウスではレトロトランスポゾン領域においてDNA脱メチル化が認められるという結果を得ている。一方、インプリンティング遺伝子においては、DNAメチル化の獲得(母型)やDNA脱メチル化(父型)のいずれも正常であった。興味深いことに、Ecat8欠損型雄マウスでは、生殖細胞特異的なsmall RNAの一種であるpiRNAの発現が著しく抑制されていた。これらの結果より、Ecat8が雄の精巣の形成や生殖細胞の発生・分化やレトロトランスポゾン領域におけるDNAメチル化にも関与し、さらに生殖細胞でのpiRNAの発現にも何らかの役割を果たしている可能性があると結論づけている。

第六章においては、本研究の結果を総合的に考察し、将来の展望を述べている。

以上、本論文は、Np95とEcat8が哺乳類の発生に重要な役割を果たしており、さらに、DNAメチル化などのエピジェネティックな制御機構にも深く関わっていることを明らかにしたものである。

これらの成果は、基礎生物学・基礎医学のみならず化学生命工学分野の発展に寄与するところが大きい。よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格であると認められる。