破骨細胞は単球・マクロファージ系前駆細胞が融合して形成される最終分化段階の多核巨細胞であり、生体内で唯一骨吸収を行う非常にユニークな細胞である。分化・成熟した破骨細胞は骨吸収を行った後、速やかに細胞死に陥る。破骨細胞による骨吸収はこれら3つのステップ、すなわち分化・機能(骨吸収活性)・生存により制御されている。本研究者らはこのうち破骨細胞の機能および生存を制御する細胞内シグナルの解明を目的として研究を行った。

まず、破骨細胞の生存に関係する細胞内シグナルについて検討を行った。骨吸収を行った破骨細胞は細胞死を迎えるが、そのほとんどがアポトーシスによる。細胞がアポトーシスを生じるメカニズムは、Bcl-2 family に属する蛋白質により調節されミトコンドリアを経由する経路と、TNF-R Tumor necrosis factor receptor family) に属すデスレセプターを介する経路の二つに大別される。破骨細胞におけるアポトーシスメカニズムについては、Bcl-2 ファミリーに属するアポトーシス誘導因子 Bim が重要な役割を果たすことが報告されている。しかしながらデスレセプターを介する経路については一定の見解が得られていない。そこで本研究者は破骨細胞のアポトーシスにおけるデスレセプター経路の関与を検討した。

デスレセプターは death domain と呼ばれる共通の構造を持ち、ここに同じくdeath domain を持つ FADD (Fas associated death domain) がリクルートされてアダプター蛋白として機能し、アポトーシスシグナルを伝達する。アデノウイルスベクターを用いてこの FADD の dominant negative 型遺伝子を破骨細胞に強制発現させたところ、アポトーシスは抑制された。また、Caspase-8 の特異的阻害剤である Z-IETD-FMK によってもアポトーシスは抑制された。このとき、破骨細胞のアポトーシスとともに上昇する Caspase-8 の活性化は抑制されていた。以上より、破骨細胞のアポトーシスにおいて FADD - Caspase-8 を介する経路が関与していることが示された。しかしながら、FADD の上流に位置するデスレセプターに対するリガンドである Fas 抗体 (Jo2)、FasL、TRAIL のいずれを投与してもアポトーシスを促進することはできなかった。したがって、破骨細胞においてはこれまでまだ報告されていないデスレセプターあるいはデスレセプターリガンドによる刺激、もしくはこういった細胞外からの刺激ではなく細胞内からの何らかのシグナルにより FADD - Caspase-8 の活性化を生じ、アポトーシスを誘導する経路があると推測される。

次に破骨細胞の機能を制御する細胞内シグナルについての研究を行った。骨吸収能に関係する key molecule の一つは c-Src である。破骨細胞において c-Src はインテグリンや c-Fms の刺激により活性化され、Pyk2 - Cbl と結合・complexを形成してこれらを活性化し、ここに class IA PI3K (Phosphatidylinositol 3 - kinase) の regulatory subunit である p85 がリクルートされることが細胞骨格の再構成および骨吸収活性に重要であることが徐々に明らかになってきた。しかしこれらはインテグリンや c-Fms の刺激により class IA PI3K が c-Src らとコンプレックスを形成すること、そしてこのコンプレックスの下流のシグナルが PI3K 阻害剤で抑制されることから推察される結果に過ぎない。一方、class IA PI3K のノックアウトマウスはその多くが胎生致死または生後早期に致死であり骨組織の解析がなされていない。そこで本研究者らは実際の生体内外での class IA PI3K による破骨細胞の制御を解明することを目的として、Cathepsin-K-Cre ノックインマウスと Pik3r1 (p85βおよびそのスプライシングバリアントである p55α、p50αをコードする) flox マウス、および Pik3r2 (p85βをコードする) ノックアウトマウスを交配させ、p85 の破骨細胞特異的ノックアウトマウスを作出・解析した。その結果、ノックアウトマウスは低代謝回転型の骨量増加を示した。また、in vitro においても破骨細胞のアクチンリング形成障害と骨吸収能の低下を認めた。一方、アポトーシスについては差が見られず、in vivo での破骨細胞数も差がなかった。これらの事実から、class IA PI3K は破骨細胞の細胞骨格および機能を制御しているが、アポトーシスについては重要な役割を果たしていないと考えられる。

本研究は破骨細胞の機能および生存を制御する細胞内シグナルの解明を明らかにすることを目的とした。生存についてはデスレセプターのアダプター蛋白である FADD (Fas associated death domain) のdominant negative 型遺伝子を強制発現させ、マウス破骨細胞のアポトーシスにおけるデスレセプター経路の関与を検討した。また機能については、破骨細胞特異的ノックアウトマウスを作出・解析することにより、class IA PI3K (Phosphatidylinositol 3 - kinase) による制御機構の解明を試みた。本研究により下記の結果を得ている。

1.マウス破骨細胞のアポトーシス過程において Caspase-8 が活性化されていることを確認した。Dominant negative 型 FADD (FADDDN)としてヒト型 FADD のdeath effector domain の一部を欠失した構造を用い、これをアデノウイルスベクターに組み込んで破骨細胞に強制発現させたもの、および Caspase-8 阻害剤投与群はアポトーシスが抑制され、生存が亢進していた。このことから破骨細胞のアポトーシスにおいて FADD - Caspase-8 を介する経路が関与していることが示された。

2.デスレセプターに対するリガンドである FasL、TRAIL、TNF-αおよび Fas の agonist として作用する抗体を投与して、破骨細胞のアポトーシスへの影響を検討した。しかしながらこれらのいずれによってもアポトーシスへの影響は見られなかった。

3.class IA PI3K による破骨細胞の制御を解明することを目的として、Cathepsin-K-Cre ノックインマウスと Pik3r1 (p85αおよびそのスプライシングバリアントである p55α、p50αをコードする) flox マウス、および Pik3r2 (p85βをコードする) ノックアウトマウスを交配させ、p85 の破骨細胞特異的ノックアウトマウスを作出した。p85αcKOマウスはコントロールマウスと比較して明らかな骨量の変化が認められなかったが、p85αcKOβ-/- マウスは p85α flox/flox β-/- マウスと比較して放射線学的および組織学的に骨量が増加していた。骨形態計測の結果は骨吸収・骨形成ともに低下していたが、破骨細胞数に違いはなかった。また骨石灰化速度に違いはなかった。これらの結果から、p85αcKOβ-/- マウスは破骨細胞の機能低下による低代謝回転型の骨量増加を示すと考えられた。

4.p85αcKOβ-/- マウス由来の骨髄細胞から分化させた破骨細胞 (p85 DKO) は細胞の広がりが少なく、アクチンもリングを形成せず瀰漫性に存在しており、細胞骨格の障害が認められた。また骨吸収窩測定により骨吸収機能を評価すると、p85 DKO 破骨細胞の骨吸収能はコントロールの 6.07±1.79 % と著明に低下していた。

5.p85 DKO 破骨細胞の生存については、増殖因子などを加えない定常状態では有意差が見られなかった。M-CSF を加えた培養条件下では p85 DKO 破骨細胞の方が生存が亢進していた。

以上、本論文は前半部分において、マウス破骨細胞のアポトーシスには FADD - Caspase-8 を介する経路が関与しており、その上流には既知のデスレセプター刺激以外からのシグナルが作用している可能性を示した。また後半部分においては、class IA PI3K が破骨細胞の細胞骨格および骨吸収機能を制御していることを明らかにした。本研究は、これまで未解明の点が数多く残されていた破骨細胞の機能および生存を制御する細胞内シグナルの解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。