【序論】

フルオレセインは、水中で高いモル吸光係数・蛍光量子収率を持ち、アルゴンレーザー(488nm)で励起可能であるなどの利点から、多くの蛍光プローブの母核として用いられてきた蛍光団である。当研究室でのこれまでの研究から、フルオレセインやその誘導体は、蛍光団であるキサンテン環部位と、それに直交するベンゼン環部位に分けて考えることができ、そのベンゼン環部位からの分子内光誘起電子移動(Photoinduced Electron Transfer、PeT)により、励起蛍光団からの蛍光が消光することが明らかになった。さらに、本知見を基にフルオレセインの高い量子収率に必須とされていたカルボキシル基を様々な置換基に置換した新規フルオレセイン類(Tbkyo Greens、以下TGと略す)の開発にも成功した。本研究では、TG骨格の分光学的特長を生かした新たな蛍光プローブの論理的設計法を確立することを目標とした。

【本論】

1.高感度β-ガラクトシダーゼ蛍光プローブ(TG-βGal)の開発

まず、TG誘導体のヒドロキシル基(pKa=6.4)がアニオン型とニュートラル型とで蛍光発光のthresholdが異なることに着目し、1)これがキサンテン環部位の電子受容能の変化に起因すること、2)キサンテン環のヒドロキシル基をエーテル化した誘導体はニュートラル型に近い電子受容能を持つことを明らかにした。そこで、この電子受容能の変化をプローブ設計に生かすべく、ニュートラル型ではPeTによる蛍光消光が起こるのに対しアニオン型では起こらないようなTG誘導体を探索した。その結果、ベンゼン環部位にm-OMe tolueneを持つ誘導体(2-Me-4-OMe TG)がアニオン型とニュートラル型とで最も大きな蛍光強度変化を示したことから、m-OMe tolueneが、キサンテン環部位の電子受容能の変化を最大限に蛍光強度変化に変換するために最適な電子供与部であることが示された(Figure 1a)。そこでまず、代表的なレポーター酵素であるβ-ガラクトシダーゼに対する蛍光プローブを開発するべく、2-Me-4-OMe TGのヒドロキシル基をβ-ガラクトシド基で保護したTG-βGalを開発した(Figure 1b)。その蛍光特性を調べたところ、予想通りβ-ガラクトシダーゼとの反応前後で大きな蛍光強度上昇を示し、フルオレセインを母核とする既存のプローブFDG(fluorescein di-β-galactopyranoside)よりも速くかつリニアーな蛍光上昇を示すことが明らかになった。さらに、生細胞でのβ-ガラクトシダーゼ活性イメージングを試みたところ、β-ガラクトシダーゼを発現した細胞でのみ速やかな蛍光上昇が観測されたことから、開発したTG-βGalは生細胞におけるlacZ発現を高感度に可視化できるプローブであることが示された(Figure 1c)。

2. 高感度アルカリフォスファターゼ蛍光プローブ(TG-Phos)の開発

次に、TG-βGalと同様のデザインストラテジーで、プロッティングやELISAの検出用酵素として汎用されているアルカリフォスファターゼ(ALP)に対するプローブTG-Phosを開発した。開発したTG-Phosは、in vitroでの検討からTG-βGal同様優れた蛍光特牲を有することが明らかになった(Figure 2a)。さらに、ターゲット蛋白であるCYP3A2を電気泳動・プロッティングし、一次抗体及びALP標識した二次抗体で処理した後、TG-Phosまたは既存のALPプローブを用いて蛍光検出を試みた。その結果、ALPによる加水分解生成物のプロット膜に対する吸着性の差異から、既存のプローブよりもTG-Phosを用いた方が、高感度にターゲット蛋白を検出可能であることが示された。また、TG-Phosとは異なる蛍光波長を有する蛋白ラベル化試薬を用いて、ターゲット蛋白と全蛋白質を同時に染色・検出することにも成功した(Figure 2b)。これらの結果から、TG骨格に基づき開発したTG-Phosは、ウェスタンブロッティングに適用可能な高感度ALP蛍光プローブであることが示された。

3. 細胞内滞留型β-ガラクトシダーゼ蛍光プローブ(AM-TG-βGal)の開発と癌イメージング

次に、TG-βGalに構造修飾を施すことで、細胞内滞留性を高めた新たなプローブを設計することを考えた。具体的なアプローチとしては、TG-βGalに水溶性基であるカルボン酸を組み込み、さらにそのカルボン酸を細胞内エステラーゼ感受性の保護基(e.g.Acetoxymethyl(AM)基)で保護したプローブを開発することを考えた。まず始めに、TG-βGalの4位のOMe基をOCH2COOMe基に置換した1Me-βGalをデザイン・合成した。この蛍光特性を精査した結果、酵素との反応前の蛍光量子収率(Φfl)が0.069となり、TG-βGal(Φfl=0.002)と比較して35倍程高いバックグラウンド蛍光を有することが明らかになった。この原因を究明するべく、1(Me)-βGalのベンゼン環部位m-OCH2COOMe tolueneについて、電子供与能の指標であるHOMOエネルギーレベルの算出を行った。その結果、OMe基からOCH2COOMe基に置換することでベンゼン環部位の電子供与能が低下し、PeTによる十分な消光が起こらなくなったことが示された(Figure 3)。そこで、OCH2COOMe基のmethylene鎖の長さを伸長することでCOOMe基の電子吸引効果を和らげることができるのではないかと考え、methylene鎖の長さ(n)を1~4と変えたベンゼン環部位に関してHOMOエネルギーレベルを算出した。その結果、nが4ならばCOOMe基による電子吸引効果がほぼなくなることが示唆されたため、ベンゼン環部位にm-O(CH2)4COOMe tolueneを有する3(Me)-βGalをデザイン・合成した(Figure 3)。その蛍光特性を精査した結果、予想通り、β-ガラクトシダーゼとの反応前のバックグラウンド蛍光を十分低く抑えることに成功した(Φfl=0.009)。さらに、3(Me)-βGalのmethylesterを細胞内エステラーゼでより加水分解の受けやすいAM esterに変換したAM-TG-βGalを開発した(Scheme 1)。開発したAM-TG-βGalは、β-ガラクトシダーゼと反応することで大きな蛍光上昇を示し、さらに細胞内のエステラーゼと反応することで水溶性が上昇するため、TG-βGalと比較して細胞内滞留性が向上していることが示された。

そこで、開発に成功したAM-TG-βGalを用いて、以下に示す二段階のストラテジーにて動物個体における癌の蛍光イメージングを行った。癌のモデルとしては、腹腔内にヒト卵巣癌由来のSHIN3癌細胞を播種したマウスを用いた。まず一段階目として、SHIN3細胞表面に提示されているlectinに認識されるAvidinとβ-ガラクトシダーゼとの複合体(Avi-βGal)をマウスに腹腔内投与し、β-ガラクトシダーゼを癌にターゲティングした。二段階目として、AM-TG-βGalを腹腔内投与し、ターゲティングされたβ-ガラクトシダーゼ活性を蛍光可視化した(Figure 4a)。投与したAM-TG弔Galは、まず始めに細胞表面にあるβ-ガラクトシダーゼにより蛍光性のAM-TGに変換され、さらに癌細胞内に取り込まれて細胞内エステラーゼと反応することで細胞内滞留性のある蛍光性生成物3に変換されると考えた。マウス腹腔内における蛍光イメージングを行った結果、癌においてのみ強い蛍光シグナルが観察され(Figure 4b)、また、腸間膜に付着した200μm程度の微小な癌をも蛍光可視化できることが明らかになった。以上、二段階のストラテジーを用いることで、癌細胞でのみ蛍光が増強され、高感度に癌を検出可能な新規癌イメージング法を確立することに成功した。本手法は、癌の摘出手術時に癌を可視化する技術(イメージガイダンス)として医療の分野で応用される可能性を秘めている。

【結論】

本研究において私は、新規フルオレセイン類(TG)のベンゼン環部位の置換基を適切に選択することにより、キサンテン環の電子受容能の変化を最大限に蛍光変化へ変換することが可能であることを見いだし、これを蛍光発光の制御原理に用いた新たなプローブ設計法を確立することに成功した。さらに、確立した設計法に則り開発したプローブは、既存のプローブでは成し得なかった特長を有し、生命科学研究及び医療の分野において真に実用的な解析・診断ツールとなりうることが示された。

Figure 1. a, Dynamic change of fluorescence quantum yields of TokyoGreen derivatives depending on the HOMO energy level of benzene moieties under basic (black circle) and acidic (black square) conditions. b, Reaction scheme of TG-βGal and photo before and after the reaction with β-galactosidase. c, Visualizing β-galactosidase activity in living cells (lacZ (+) or lacZ (-)) with TG-βGal.

Figure 2. a, Reaction scheme of TG-Phos with ALP. b, Fluorescence detection of CYP3A2 by TG-Phos (Green) and total protein by BODIPY TR-X, SE (Red) on the blotting membranes. The six lanes contain decreasing amounts of CYP3A2 (250, 125, 63, 31, 16, 8 ng).

Figure 3. Relationship between the calculated HOMO energy level of the benzene moiety and On of TG-βGal, l(me)-βGal, and 3(me)-βGal.

Scheme 1. Reaction scheme of AM-TG-βGal with β-galactosidase and esterase.

Figure 4. a, Two-step strategy for imaging tumors by using Avi-βGal and AM-TG-βGal. b, In vivo fluorescence imaging of SHIN3 tumor (arrows). Left; Unmixed fluorescence image, Right; white light image.

フルオレセインは、水中で高いモル吸光係数・蛍光量子収率を持ち、アルゴンレーザー(488mm)で励起可能であるなどの利点から、多くの蛍光プローブの母核として用いられてきた蛍光団である。当研究室でのこれまでの研究から、フルオレセインやその誘導体は、蛍光団であるキサンテン環部位と、それに直交するベンゼン環部位に分けて考えることができ、そのベンゼン環部位からの分子内光誘起電子移動(Photoinduced Electron Transfer、PeT)により、励起蛍光団からの蛍光が消光することが明らかになった。さらに、本知見を基にフルオレセインの高い量子収率に必須とされていたカルボキシル基を様々な置換基に置換した新規フルオレセイン類(Tbkyo Greens、以下TGと略す)の開発にも成功した。そこで神谷さんは、TG骨格の分光学的特長を生かした新たな蛍光プローブの論理的設計法を確立し、従来法では開発し得なかった蛍光プローブの開発を目指し、研究に着手した。

1. 高感度β-ガラクトシダーゼ蛍光プローブ(TG-βGal)の開発

神谷さんはまず、TG誘導体のヒドロキシ基(pKa=6.4)がアニオン型とニュートラル型とで蛍光発光のthresholdが異なることに着目し、1)これがキサンテン環部位の電子受容能の変化に起因すること、2)キサンテン環のヒドロキシ基をエーテル化した誘導体はニュートラル型に近い電子受容能を持つことを明らかにした。次にこの電子受容能の変化をプローブ設計に生かすぺく、ニュートラル型ではPeTによる蛍光消光が起こるのに対しアニオン型では起こらないようなTG誘導体を探索し、ぺンゼン環部位にm2-OMe tolueneを持つ誘導体(2-Me-4-OMe TG)がアニオン型とニュートラル型とで最も大きな蛍光強度変化を示すことを見いだした。すなわち、m2-OMe tolueneがキサンテン環部位の電子受容能の変化を最大限に蛍光強度変化に変換するために最適な電子供与部であり、2-Me-4-OMe TGを蛍光プローブの母核とする全く新たなプローブ設計法の確立に成功した。そこで本設計法に基づき、代表的なレポーター酵素であるβ-ガラクトシダーゼに対する蛍光プローブの開発に着手し、2-Me-4-OMe TGのヒドロキシ基をβ-ガラクトシド基で保護したTG-Galを合成・開発した。その蛍光特性を調べたところ、予想通りβ-ガラクトシダーゼとの反応前後で大きな蛍光強度上昇を示し、フルオレセインを母核とする既存のプローブFDG(且uorescehl di-β-galactopyranoside)よりも速くかつリニアーな蛍光上昇を示すことが明らかになった。さらに、生細胞でのβ-ガラクドシダーゼ活性イメージングを試みたところ、β-ガラクトシダーゼを発現した細胞でのみ速やかな蛍光上昇が観測されたことから、開発したTG-βGalは生細胞におけるlacZ発現を高感度に可視化できるプローブであることが示された。

2.高感度アルカリフォスファターゼ蛍光プローブ(TG-Phos)の開発

次に、TG-βGalと同様のデザインストラテジーで、プロッティングやELISAの検出用酵素として汎用されているアルカリフォスファターゼ(ALP)に対するプローブTG-Phosを開発した。開発したTG-Phosは、in virtroでの検討からTG-βGal同様優れた蛍光特性を有することが明らかになった。さらに、ターゲット蛋白であるCYP3A2を電気泳動・プロッティングし、一次抗体及びALP標識した二次抗体で処理した後、TG-Phosまたは既存のALPプローブを用いて蛍光検出を試みた結果、既存のプローブよりもTG-Phosを用いた方が、高感度にターゲソト蛋白を検出可能であることが示された。さらにTG-Phosとは異なる蛍光波長を有する蛋白ラベル化試薬を用いることで、ターゲット蛋白と全蛋白質を同時に染色・検出することにも成功した。以上の結果から、TG骨格に基づき開発したTG-Phosは、ウェスタンブロッティングに適用可能な高感度ALP蛍光プローブであることが示された。

3.細胞内滞留型β-ガラクトシダーゼ蛍光プローブ(AM-TG-βGal)の開発と癌イメージング

次に、TG-βGalに水溶性基であるカルボン酸を組み込み、さらにそのカルボン酸を細胞内エステラーゼ感受性の保護基(e.g. Acetoxymethyl(AM)基)で保護したプローブを開発することで、TG-βGalに比して細胞内滞留性に優れた新たなプローブの開発を試みた。まず始めに、TG-βGalの4位のOMe基をOCH2COOMe基に置換した1(Me)-βGalをデザイン・合成した。この蛍光特性を精査した結果、酵素との反応前の蛍光量子収率(Φfl)が0.069となり、TG-βGal(Φfl=0.002)と比較して35倍程高いバックグラウンド蛍光を有することが明らかになった。この原因を究明するべく、1(Me)-βGalのベンゼン環部位m-OCH2COOMe tolueneについて、電子供与能の指標であるHOMOエネルギーレベルの算出を行った。その結果、OMe基からOCH2COOMe基に置換することでベンゼン環部位の電子供与能が低下し、PeTによる十分な消光が起こらなくなったことが示された。そこで、OCH2COOMe基のmethylene鎖の長さを伸長することでCOOMe基の電子吸引効果を和らげることができるのではないかと考え、methylene鎖の長さ(n)を1~4と変えたベンゼン環部位に関してHOMOエネルギーレベルを算出した。その結果、nが4ならばCOOMe基による電子吸引効果がほぼなくなることが示唆されたため、ぺンゼン環部位にm-O(CH2)4COOMe tolueneを有する3(Me)-βGalをデザイン・合成した。その蛍光特性を精査した結果、予想通り、β-ガラクトシダーゼとの反応前のバックグラウンド蛍光を十分低く抑えることに成功した(Φfl=0.009)。さらに、3(Me)-βGalのmethylesterを糸田胞内エステラーゼでより加水分解の受けやすいAMesterに変換したAM-TG-βGalを開発した。開発したAM-TG-βGalは、β-ガラクトシダーゼと反応することで大きな蛍光上昇を示し、さらに細胞内のエステラーゼと反応することで水溶性が上昇するため、TG-βGalと比較して細胞内滞留性が向上していることが示された。

そこで、開発に成功したAM-TG-βGalを用いて、以下に示す二段階のストラテジーにて動物個体における癌の蛍光イメージングを行った。癌のモデルとしては、腹腔内にヒト卵巣癌由来のSHIN3癌細胞を播種したマウスを用いた。まず一段階目として、SHIN3細胞表面に提示されているlectinに認識されるAvidinとβ-ガラクトシダーゼとの複合体(Avi-βGal)をマウスに腹腔内投与し、β-ガラクトシダーゼを癌にターゲティングした。二段階目として、AM-TG-βGalを腹腔内投与し、ターゲティングされたβ-ガラクトシダーゼ活性を蛍光可視化した。投与したAM-TG-βGalは、まず始めに細胞表面にあるβ-ガラクトシダーゼにより蛍光性のAM-TGに変換され、さらに癌細胞内に取り込まれて細胞内エステラーゼと反応することで細胞内滞留性のある蛍光性生成物3に変換されると考えた。マウス腹腔内における蛍光イメージングを行った結果、癌においてのみ強い蛍光シグナルが観察され、また、腸間膜に付着した200μm程度の微小な癌をも蛍光可視化できることが明らかになった。以上、二段階のストラテジーを用いることで、癌細胞でのみ蛍光が増強され、高感度に癌を検出可能な新規癌イメージング法を確立することに成功した。本手法は、癌の摘出手術時に癌を可視化する技術(イメージガイダンス)として医療の分野で応用される可能性を秘めている。

以上のように神谷さんは、新規フルオレセイン類(TG)のベンゼン環部位の置換基を適切に選択することにより、キサンテン環の電子受容能の変化を最大限に蛍光変化へ変換することが可能であることを見いだし、これを蛍光発光の制御原理に用いた新たなプローブ設計法を確立することに成功した。本設計法は極めて汎用性に富むものであり、実際神谷さんは、β-ガラクトシダーゼ(TG-βGal)、アルカリフォスファターゼ(TG-Phos)など広範なターゲットに対する高感度蛍光プローブの開発に成功した。さらに、TG-βGalの優れた蛍光特性、酵素反応性を保ったまま、細胞内滞留性を増大させた新たなβ-ガラクトシダーゼ蛍光プローブ(AM-TG-βGal)の開発に成功し、これを独自の二段階戦略と組み合わせることで、微小癌の高感度イメージングにも成功した。このように、全く新しい蛍光プローブの論理的な開発を通じて、生命科学研究及び医療の分野に革新的な解析・診断ツールを提供することに成功した神谷さんの成果は極めて優れたものであり、博士(薬学)の学位に十分値するものと認められるものである。