海馬は記憶学習を担う重要な脳部位であり、海馬内神経回路のシナプス伝達や可塑性については分子レベルでの解明が進んでいる。しかし、海馬機能を明らかにするために重要な海馬全体および他の脳部位を介する神経回路の調節とその調節メカニズムについての解明は非常に遅れている。近年海馬長軸方向における機能の違いが注目され、背側海馬は認知や空間学習により重要であり、腹側海馬は恐怖不安などに関与することが言われている。

このように海馬長軸方向における機能違いは、背側海馬と腹側海馬が異なる脳部位と神経連絡があり、他の脳部位の神経回路から調節をうけることによるものだと考えられる。扁桃体と海馬の間では、相互に嗅内野皮質を介した間接投射と介さない直接投射があると報告されている。扁桃体が間接投射を介し、海馬歯状回のシナプス可塑性を双方向に調節していることは、当研究室よりすでに報告しているが、直接投射についてはほとんど知見がない。私は修士課程において、密な投射があると言われている後部扁桃体基底核から腹側海馬CA1野への投射経路(以下BA経路と略す)の性質及び可塑性を研究し、この直接経路がグルタミン酸作動性神経経路であり、シナプス可塑性がストレスに影響されやすいことを明らかにした。しかし、海馬内の重要な情報伝達経路であるSchaffer側枝-CA1経路(以下Sch経路と略す)との調節関係は知られていない。そこで、私は博士課程において、invivoでの電気生理学及び薬理学的な実験手法を用いて、両神経経路の相互調節作用及びそのメカニズムの解明について研究した。

1.両経路における通常伝達の相互調節In vivoで両経路の誘発細胞外興奮性シナプス電場電位(fEPSP)の同時記録方法を確立した後、それぞれの先行刺激による他方の通常伝達への調節について検討した。数十ミリセカンドの間隔をおいて、BA経路先行刺激がある時のSch経路のfEPSPとBA経路先行刺激がない時の通常伝達を比較した(Fig.1)。短い刺激間隔の時はSch経路の通常伝達が抑制されるが、刺激間隔が長くなると、抑制調節がほとんどなくなった。一方、Sch経路を先行刺激すると、黒丸に示すようにBA経路の通常伝達が長時間にわたって抑制された。つまり、二つの経路はそれぞれ他方に対する調節効果が異なっている。また、Sch経路先行刺激によるBA経路への伝達抑制は約400ms持続した。一方、BA経路先行刺激の刺激強度を強くするために、バースト刺激を与えると、Sch経路の通常伝達が長時間にわたって抑制され、BA経路に与える刺激の強度に依存することがわかった。以上のことから、BA経路とSch経路において、入力のタイミングと強さによって、他方への調節が異なり、両経路間におけるシナプス伝達のしやすさに違いがあると考えられる。

2.両経路における相互調節のメカニズム解析

この長時間にわたる抑制のメカニズムについて検討した。中枢神経系における抑制性神経は主にGABA作動性神経で、GABA受容体には二つのサブタイプがあり、イオンチャンネル共役型のGABAA受容体を介した抑制作用は時間経過が速いので、ゆっくりとした抑制作用があるGABAB受容体に注目した。また、脳内Gタンパクカップリング受容体の中で一番多く存在するカンナビノイド受容体のサブタイプであるCB,受容体を介したプレシナプス側からの神経伝達物質放出減少による抑制も考えられたので、GABAB受容体アンタゴニストであるCGP55845とCB1受容体アンタゴニストであるAM251を用いて検討した。

まず、BA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制への関与を検討した。GABAB受容体アンタゴニストを適用前と適用後それぞれBA経路バースト刺激によるSch経路の伝達抑制を記録した。その結果はFig.3のAに示す。Sch経路の伝達抑制が長い刺激間隔の時に、有意に小さくなった。また、Bに示すようにCB1受容体のアンタゴニストを適用後は短い刺激間隔においても抑制が有意に小さくなった。

次に、Sch経路先行刺激によるBA経路の伝達抑制への関与についても検討した。GABAB受容体アンタゴニストを適用後、短い刺激間隔においては抑制が有意に小さくならなかったが、長い刺激間隔においては、有意に小さくなり、さらに長い刺激間隔ではむしろ上昇に転じた。一方、CB1受容体のアンタゴニスト適用後は、適用前と有意な差が認められなかった(Fig.4)。

GABAB受容体アンタゴニストを適用後、さらに長い刺激間隔でのシナプス伝達が上昇に転じたメカニズムについて検討した。そこでプレシナプス側の神経伝達物質放出確率の変化を反映するPPFに注目した。BA経路とSch経路において、短い刺激間隔ではPPFが生じるが、GABAB受容体アンタゴニストを適用後、BA経路とSch経路の短い刺激間隔において、PPFが有意に大きくなっていることがわかった。一方、CB,受容体のアンタゴニストを適用後、両経路のPPFに変化が認められなかった。この結果から、プレシナプス側に存在するGABAB受容体が興奮性神経伝達物質の放出確率に影響していることが示唆された。

以上の結果をまとめると、BA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制には、GABAB受容体とCBS受容体を介した二つの抑制系が関与している。また、Sch先行刺激によるBA経路の伝達抑制には、GABAB受容体を介した抑制系が関与することが示唆された。興奮性神経経路間における相互調節には、抑制性神経の関与が必要だけでなく、神経回路によって、ポストシナプス側の興奮により活性化されたレトロメッセンジャーによるフィードバックな抑制作用も必要であることが示唆された。

3.ストレス状態における両経路の相互調節

海馬と扁桃体の機能はストレスにより大きく影響されることが数多く報告されている。ストレスがかかると、主に視床下部-下垂体-副腎軸(HPA-axis)が活性化され、副腎からステロイドホルモンの分泌が増加され、それぞれ海馬と扁桃体にある受容体に作用し、その機能に影響する。ストレス状態における両経路の相互調節もストレスにより影響される可能性があるので、それについて検討した。

そこで、Foot Shockストレスと拘束ストレスの二種類のストレスを用いて検討した。FootShockストレス後BA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制に変化が認められなかった(Fig.5)。これに対して、拘束ストレス後BA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制がさらに増強されることがわかった(Fig.6)。一方、Sch経路先行刺激によるBA経路の伝達抑制においては、Foot Shockストレスも拘束ストレスも有意な変化が認められなかった。Foot Shockストレスと拘束ストレスがともにBAの活動を活性化させるが、両ストレスによるBA経路伝達の増大に差がなかった。しかし、BA経路先行刺激によるSch経路の伝達抑制に差が生じた。このことから、ストレスの種類によって、両経路伝達の相互調節への影響が異なることが示唆された。

4.BA刺激によるSch経路シナプス長期可塑性への調節

シナプス長期可塑性とはシナプス伝達効率の変化が長時間にわたって持続することで、海馬におけるシナプス長期可塑性は記憶学習の素過程として幅広く研究されている。BA経路の刺激によるSch経路のシナプス長期可塑性への調節は情動が記憶を調節するメカニズムの究明に非常に重要な意味を持っていると考えられるので、BA経路刺激によるSch経路のシナプス長期可塑性への調節について検討した。

まず、BAとSchにシナプス長期可塑性の一つである長期増強(LTP)が誘導できるθバースト刺激を同時に与えて検討した。すると、Sch経路のLTP誘導が阻害された。また、BA経路に単独の長期抑圧(LTD)が誘導できる刺激を与えた直後と20分後にもSch経路のLTP誘導が阻害された。つまり、BA経路に可塑性が起こるような様々の活動が入ると、Sch経路のシナプス長期可塑性が抑制されることが示唆された。

本研究はin vivoの電気生理学的実験を用いて、BA経路とSch経路間のシナプス伝達および可塑性の相互調節について検討し、以下のことを明らかにした。

BA経路とSch経路先行刺激がそれぞれ他方の通常伝達を抑制し、その入力の強さとタイミングに依存している。GABAB受容体とCB1受容体を介した抑制系が関与するが、その程度は神経経路によって異なる。また、BA経路とSch経路先行刺激による相互の伝達抑制はストレスによる影響が異なる。さらにBA経路の様々な活性化によってSch経路の長期可塑性が抑制された。

BAのダイナミックな活動により、腹側海馬CA1野のシナプス伝達や可塑性が大きく抑制され、海馬の活動が調節されている。情動を司る扁桃体から恐怖不安などに関わると言われている腹側海馬への直接神経投射経路が腹側海馬内神経回路との相互調節及びそのメカニズムの解明によって、入力タイミングによって起きるシナプス可塑性に重要な知見を与えるだけでなく、情動による記憶への調節メカニズムの究明に大きく貢献できると思われる。また、この相互調節がストレス状態における変化とそのメカニズムを明らかにすることによって、ストレス由来の情動に関わる病気の原因究明につながることになると考えられる。

Fig.1 先行刺激による神経伝達への抑制調節BAを先行刺激して、Sch-CA1経路のfEPSPがベース応答に対する割合は白丸(○)に示す。Sch先行刺激によるBA-CA1経路の抑制は黒丸(●)に示す(N=6)。

Fig.2 BA先行刺激によるsch-CA1経路の伝達抑制はBAの強度によって異なる

BAにそれぞれ200Hzの間隔で2回(○、5回(●)、10回(●)を先行刺激すると、Sch-CA1経路の伝達抑制は刺激が強くなるにつれ、有意に抑制が大きくなる。(*p<0.05,**p<0.01, 2trains vs. 10trains; $p<0.05, $$p<0.01, 2trains vs. 5trains; #p<0.05, ##p<0-01, 5trains vs. 10trains; Tukey test after two-way ANOVA. N=13)

Fig.3 CGP 55845及びAM251がBA経路先行刺激によるSch経路の伝達抑制への影響

A:GABAB受容体アンタゴニストであるCGP55845適用後、長い間隔における抑制が有意に小さくなった。

B:CB1受容体アンタゴニストであるAM251適用後、短い間隔も長い間隔も有意に抑制が小さくなった。

(*p<0.05,**p<0.01,Paired t-test after two-way ANOVA. 5trains N=6 or 7)

Fig.4 CGP 55845及びAM251がSch経路先行刺激によるBA経路の伝達抑制への影響

A: CGP 55845適用後長い刺激間隔における抑制が有意に小さくなった。

B:AM251適用後抑制に有意な差が認められなかった。

(*p<0.05, Paired t-test after two-way ANOVA. N=6 or 5)

Fig.5 Foot Shockストレスにおける抑制調節の変化Foot Shockストレス後BA経路先行刺激(Strains)によるSch経路の伝達抑制がストレスなしの時と変化が認められなかった。(N=6)

Fig.6 拘束ストレスにおける抑制調節の変化拘束ストレス後BA経路先行刺激(Strains)によるSch経路の伝達抑制がストレスなしの時に比べ、有意に大きくなった。(*p<0.05,**p<0.01,Student's t-test after two-way ANOVA. N=6)

海馬は記憶学習を担う重要な脳部位であり、海馬内神経回路のシナプス伝達や可塑性については分子レベルでの解明が進んでいる。しかし、海馬機能を明らかにするために重要な海馬全体および他の脳部位を介する神経回路の調節とその調節メカニズムについての解明は非常に遅れている。近年海馬長軸方向における機能の違いが注目され、背側海馬は認知や空間学習により重要であり、腹側海馬は恐怖不安などに関与することが示唆されている。その原因として、背側海馬と腹側海馬が異なる脳部位から調節をうけるためと考えられる。

扁桃体と海馬の間では、相互に嗅内野皮質を介した間接投射と介さない直接投射がある。扁桃体が間接投射を介し、海馬歯状回のシナプス可塑性を双方向に調節していることは、当研究室よりすでに報告しているが、直接投射についてはほとんど知見がない。私は修士課程において、密な投射があると言われている後部扁桃体基底核から腹側海馬CA1野への投射経路(以下BA経路と略す)の性質及び可塑性を研究し、この直接経路がグルタミン酸作動性神経経路であり、シナプス可塑性がストレスに影響されやすいことを明らかにした。しかし、海馬内の重要な情報伝達経路であるSchaffer側枝-CA1経路(以下Sch経路と略す)との調節関係は知られていない。そこで、in vivoでの電気生理学及び薬理学的な実験手法を用いて、両神経経路の相互調節作用及びそのメカニズムの解明に取り組んだ。

1,両経路における通常伝達の相互調節

in vivoで両経路の誘発細胞外興奮性シナプス電場電位(fEPSP)の同時記録方法を確立した後、それぞれの先行刺激による他方の通常伝達への影響について検討した。数十ミリ秒の間隔をおいて、BA経路を先行刺激するとSch経路の通常伝達が抑制されたが、刺激間隔が長くなると、抑制がほとんど消失した。一方、Sch経路を先行刺激すると、BA経路の通常伝達が長時間にわたって抑制された。つまり、二つの経路はそれぞれ他方に対する作用が異なっていた。また、Sch経路先行刺激によるBA経路への伝達抑制は約400ミリ秒持続した。一方、BA経路先行刺激をバースト刺激にすると、Sch経路の通常伝達が長時間にわたって抑制された。以上のことから、BA経路とSch経路は、入力のタイミングと強さによって、他方への調節が異なり、両経路間におけるシナプス伝達のしやすさに違いがあると考えられた。

2,両経路における相互調節のメカニズム解析

長時間にわたる抑制のメカニズムを検討した。中枢神経系における抑制性神経は主にGABA作動性神経である。GABA受容体には二つのサブタイプがあるが、イオンチャンネル共役型のGABAA受容体を介した抑制作用とすると時間経過が速すぎるので、GABAB受容体に注目した。

また、Gタンパク質共役受容体の中で脳内に-番多く存在するカンナビノイド受容体のサブタイプであるCB1受容体を介したプレシナプス側からの神経伝達物質放出減少による抑制も考えられたので、GABAB受容体拮抗薬であるCGP55845とCB1受容体拮抗薬であるAM251を用いて検討した。

まず、BA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制は、刺激間隔が長いときにGABAB受容体拮抗薬で小さくなった。また、CB1受容体拮抗薬によっては、,刺激間隔に無関係に抑制が有意に小さくなった。次に、Sch経路先行刺激によるBA経路の伝達抑制は、刺激間隔が長いときに、GABAB受容体拮抗薬で小さくなり、さらに長い刺激間隔ではむしろ上昇に転じた。

このとき、二連刺激による伝達促進が大きくなっており、シナプス前作用であることが確認できた。一方、CB1受容体拮抗薬は影響しなかった。

以上の結果をまとめると、BA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制には、GABAB受容体とCB1受容体を介した二つの抑制系が関与し、Sch先行刺激によるBA経路の伝達抑制には、GABAB受容体を介した抑制系が関与することが示唆された。興奮性神経経路間における相互調節には、抑制性神経の関与が必要だけでなく、神経回路によっては、後シナプス側の興奮により活性化された逆行性メッセンジャーによるフィードバック抑制も必要であることが示唆された。

3.ストレス状態における両経路の相互調節

海馬と扁桃体の機能はストレスにより大きく影響されることが数多く報告されている。ストレス下では、主に視床下部一下垂体一副腎軸が活性化され、副腎からステロイドホルモンの分泌が増加して、海馬や扁桃体にある受容体に作用する。両経路の相互調節に対するストレス状態の影響を検討した。Foot Shockと拘束の二種類のストレスを用いて検討した。Foot ShockストレスではBA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制に影響が認められなかったのに対して、拘束ストレスではBA経路先行バースト刺激によるSch経路の伝達抑制がさらに増強された。一方、Sch経路先行刺激によるBA経路の伝達抑制においては、Foot Shockストレスも拘束ストレスも有意な変化が認められなかった。Foot Shockストレスと拘束ストレスがともにBAの活動を活性化させるが、両ストレスによるBA経路伝達の増大に差がなかった。しかし、BA経路先行刺激によるSch経路の伝達抑制に差が生じたことから、ストレスの種類によって、両経路伝達の相互調節への影響が異なることが示唆された。

4.BA刺激によるSch経路シナプス長期可塑性への調節

シナプス長期可塑性とはシナプス伝達効率の変化が長時間にわたって持続することで、海馬におけるシナプス長期可塑性は記憶学習の素過程として幅広く研究されている。BA経路の刺激によるSch経路のシナプス長期可塑性への調節は情動が記憶を調節するメカニズムの究明に非常に重要な意味を持っていると考えられる。まず、BAとSchにシナプス長期可塑性の-つである長期増強(LTP)が誘導できるθバースト刺激を同時に与えて検討した。すると、Sch経路のLTP誘導が阻害された。また、BA経路に単独の長期抑圧(LTD)が誘導できる刺激を与えた直後と20分後にもSch経路のLTP誘導が阻害された。つまり、BA経路に可塑性が起こるような様々の活動が入ると、Sch経路のシナプス長期可塑性が抑制されることが示唆された。

本研究はin vivoの電気生理学的実験を用いて、BA経路とSch経路間のシナプス伝達および可塑性の相互調節について検討し、以下のことを明らかにした。(1)BA経路とSch経路先行刺激がそれぞれ入力の強さとタイミングに依存して他方の通常伝達を抑制する、(2)その抑制にはGABAB受容体とCB1受容体が関与するが、その程度は神経経路によって異なる、(3)BA経路とSch経路先行刺激による相互の伝達抑制はストレスによる影響が異なる、(4)BA経路の様々な活性化によってSch経路の長期可塑性が抑制される。

BAのダイナミックな活動により、腹側海馬CA1野のシナプス伝達や可塑性が強く抑制されることを明らかにした。情動による記憶への調節メカニズムの究明に大きく貢献する研究であり、博士(薬学)の学位授与に値するものと判定した。